BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––––
NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT
CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN
XUẤT VACCINE THỰC VẬT
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.01.21
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2013

1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm
trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm
A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cm đã lan truyền trên 40
quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi.  nước ta, dịch
cúm gia cm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt
hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cm và ảnh hưởng đến sức
khoẻ con người. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm
A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống
chế bệnh là yêu cu thực tiễn đặt ra. Vaccine ăn được từ thực vật là
vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như
vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất
trong những phn ăn được như lá, củ, quả và hạt.  Việt Nam, đậu
tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm
chính cho vật nuôi và con người. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất
đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an
toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp
trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang
phát triển.Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án
là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus
H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, HA1 của virus
cúm A/H5N1;
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen HA1
và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.

2
3. Nội dung nghiên cứu

dòng cây đậu tương ở thế hệ T
0

3
mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1.
4.4.  thế hệ T
1
đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang
đoạn gen HA1op và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của
dòng đậu tương H11.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen
HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công
gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây
đậu tương. Với việc lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương, tạo cây đậu tương chuyển
gen và đã biểu hiện thành công gen HA1 của virus H5N1 trong hạt
đậu tương.
Về thực tiễn: với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công
trong hạt đậu tương ở thế hệ T1 làm tiền đề cho việc kiểm tra đáp
ứng khả năng miễn dịch của gia cm đồng thời làm cơ sở cho việc
sản xuất vaccine ăn được ở thực vật.
6. Cấu trúc luận án: Gồm 110 trang, được chia thành các phn: Mở
đu: 4 trang, chương 1: tổng quan tài liệu 43 trang, Chương 2: vật
liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang, Chương 3: kết quả nghiên
cứu và thảo luận: 43 trang, Kết luận: 2 trang, các bài báo liên quan
đến luận án:1 trang. Với 156 tài liệu tham khảo luận án gồm 37 hình,
16 bảng.

Chương 1

Các loại vaccine sử dụng phòng chống bệnh cúm A/H5N1 bao gồm
vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen,
vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo, vaccine ăn được ở thực vật. 
Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đang được tiến hành
trên đối tượng thực vật như cây đậu tương và đã thành công trong
việc biểu hiện gen HA trên cây thuốc lá.Tạo vaccine thực vật là một

5
hướng đi cn thiết nhưng cho đến nay vẫn chưa có vaccine thực vật
mang gen HA được đưa vào sử dụng. Mặc dù kết quả nghiên cứu còn
khiêm tốn, nhưng đy hứa hẹn trong tương lai sẽ có nhiều mô hình
vaccine thực vật phòng bệnh cho người và vật nuôi sẽ được phát triển
ở Việt Nam.

Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT,THIẾT BỊ
Nguyên liu thực vật:
Giống đậu tương ĐT12 và DT84 do Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm- Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
Chủng vi khun và các loại vector:
Vector pPTN289; pDest-phaso do VUB cung cấp, gen HA của
virus A/H5N1 do viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các chủng vi
khuẩn E. coli DH5 và A.tumefaciens CV58, EHA101 do Phòng Công
nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Hóa chất,thiết bị:
Đề tài sử dụng một số hóa chất và các trang thiết bị của Phòng
Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

chuyển lên màng nitrocellulose Hybond
TM
(Amersham). Màng lai đã
được rửa bằng TBS và block với 3% BSA trong 1 giờ. Sau đó màng
được rửa tiếp và ủ với kháng thể c-myc trong TBS bổ sung 0.5%
BSA và 0.05% Tween 20. Sau thời gian 1 giờ, màng được rửa và ủ
với kháng thể 2 có gắn ALP hoặc kháng thể IgG của chuột cộng hợp
với horseradish peroxidase HRP (Abcam). Sau khi rửa ln cuối màng
được ủ trong NBT/BCIP hoặc sử dụng bộ kit EDL
TM
(Amersham) để
phát hiện protein tái tổ hợp. 7
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ
ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA
Các tế bào miễn dịch không phản ứng hoặc không nhận diện
toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chúng chỉ nhận diện những vị trí
nhất định trên phân tử kháng nguyên. Những vị trí đó được gọi là
epitope hoặc vị trí quyết định kháng nguyên. Dựa trên công bố của
một số công trình nghiên cứu về epitope trên gen HA của H3N1 các
trình tự của epitope B và T được xác định các epitope B và T nằm ở
các vị trí tương ứng là 91-108 và 307-319. Trình tự HA của A/H5N1
(AJ867074) cho thấy ở các vị trí này trình tự amino acid có độ tương
đồng cao với các epitope trên. Vector biểu hiện trong thực vật bao
gồm một cấu trúc SLHEP chứa signal peptide (2S2), các epitope B và

Hình 3.3. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen
HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA chun 1kb)
Ghép nối đon gen HA vào vector p201-SLHEP
Sản phẩm thôi gel được xử lý đồng thời bởi hai enzym
XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có 2
vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cn chuyển sẽ được xen vào
giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh
1 M 1,7kb

9
kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn
lạc mang plasmid mong muốn. Nhờ enzyme nối mà các đu của sản
phẩm PCR sẽ được ghép vào vector, kết quả plasmid tái tổ hợp p201-
SLHEP-HA được tạo thành.
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hn ch
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA đã được gắn vào vector
chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme
giới hạn XhoI/HindIII. Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng 2
enzyme giới hạn XhoI/HindIII sẽ thu được sản phẩm gồm 2 phân
đoạn DNA: (i) Đoạn gen HA cn chèn vào vector bị cắt ở 2 đu bởi 2
enzyme giới hạn có kích thước khoảng 1,7kb và (ii) Khung vector
còn lại sau khi cắt bỏ gen chèn có kích thước khoảng 2,5kb. Sản
phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết
quả thể hiện trong Hình 3.7.

kb. Còn kết quả kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI cho thấy
sản phẩm cắt thu được 3 đoạn DNA có kích thước khoảng 2,2kb,
5kb và 10 kb. Các kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính
toán theo lý thuyết (Hình 3.9).
Hình 3.9.Kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-HAop A: Kết quả
kiểm tra bằng PCR, và B: kết quả kiểm tra bằng phản ứng ct bởi
enzyme hạn chế EcoRI. M: thang chun 1 Kb; 1, 2, 3: mu vector tái
tổ hợp tách t các dòng khun lạc
Chúng tôi lựa chon dòng plasmid số 1 sử dụng cho biến nạp
vào vi khuẩn A. tumefaciens.
3.1.1.4. Kt quả to dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Để kiểm tra hoạt động của gen HA trên vector tái tổ hợp trong
cây trồng cũng như tạo ra nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình chuyển
gen vào cây đậu tương thì vector tái tổ hợp pPhaso-HAop đã được biến

11
nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung điện Kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% với cặp mồi đặc hiệu XhoI/HindIII-
HA trên Hình 3.10 cho thấy dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả
dương tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thước 1,7kb.
Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector pPhaso-HAop
vào tế bào A. tumefaciens và như vậy chúng tôi đã tạo được chủng
Agrobacterium mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-HAop.

Hình 3.10. Hình ảnh đin di sản phm PCR kiểm tra vector
biếnnạp trong chủng Agrobacterium tumefaciens CV58
M: Thang DNA chun 1 kb; 1-2: Dòng khun lạc A. tumefaciens

3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1
Gen HA có kích thước tương đối lớn (1,7kb), epitope B và T

Hình 3.13. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả PCR
nhân đoạn gen HA1 bằng XhoI-HA/HindIII-HA

Kết quả ở Hình 3.13 cho thấy một đoạn DNA có kích thước
khoảng 1,25kb phù hợp với chiều dài của gen HA1 quan tâm đúng theo
tính toán lý thuyết và sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lượng
cho thí nghiệm tách dòng. Từ kết quả chọn dòng gen và tách
plasmide tái tổ hợp mang đoạn gen HA1 và tiến xác định trình tự
đoạn gen HA1 trên thiết bị đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA
capillary electrophoresis system.
Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector p201-SLHEP
Tiến hành thí nghiệm tương tự như thiết kế vector chuyển gen
mang cấu trúc gen HA, sản phẩm thôi gel sau đó được xử lý đồng
thời với 2 enzym XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP.
Trên vector có 2 vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cn chuyển
sẽ được xen vào giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng 13
kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các
dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn Kết quả thu được các
khuẩn lạc mọc được trên môi trường chọn lọc và có thể kết luận sơ
bộ rằng đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp p201- SLHEP-
HA1 vào tế bào E. coli. Để có thể chọn lọc được những dòng khuẩn
lạc mang vector chứa gen HA1 còn nguyên vẹn như mong muốn,
chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid từ những khuẩn lạc này và
kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn.
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme ct hạn chế
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA1 đã được gắn vào vector
chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme giới
Hình 3.16. Hình ảnh đin di kiểm tra vector chuyển gen mang cấu
trúc pPhaso-SLEHP-HA1
M: Thang DNA chun; 1-5 : Dòng khun lạc; Hàng trên: Kết quả
kiểm tra bằng PCR với cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1; Hàng
dưới: Sản phm ct bởi enzyme Hind III 15
Kt quả bin np pPhaso – SLEHP- HA1 vào vi khuẩn
Agrobacterium
Chúng tôi sử dụng 50-100ng plasmid pPhaso-SLEHP-HA1
để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens. Sản phẩm của quá
trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng
sinh, ủ đĩa ở 28
o
C. Sau 2 ngày, kết quả thu được một lượng lớn
khuẩn lạc trên đĩa thạch. Để chọn ra những dòng khuẩn lạc như
mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành
kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
với cặp mồi đặc hiệu XhoI- HA1/HindIII-HA1 được thể hiện trên
Hình 3.17 cho thấy dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả dương

Mẫu sau khi gây tổn thương và cắt bỏ đỉnh sinh trưởng, chúng
được tạo đa chồi trên 5 loại môi trường (SIM1-SIM5) chứa nồng độ
BAP từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l, kết quả thu được đối với giống ĐT12
khi bổ sung 2mg/l BAP vào môi trường SIM tỷ lệ tạo chồi và số chồi
trung bình/cụm thu được đạt giá trị cao nhất (82,3% và 6,2
chồi/cụm), trong khi đó với giống DT84, tỷ lệ tạo chồi và số
chồi/cụm đạt giá trị cao nhất ở môi trường bổ sung 1,5 mg/l BAP
(41,6% và 3,4 chồi/cụm), các giá trị này thấp hơn nhiều so với giống
ĐT12. Ngoài ra bằng quan sát chúng tôi nhận thấy rằng chất lượng
chồi của giống DT84 thu được khỏe hơn, phát triển tốt hơn so với
chồi ĐT12.
Ảnh hưởng của GA
3
và IAA tới khả năng kéo dài chồi
Các cụm chồi tạo trên môi trường cảm ứng chồi tốt nhất được
chuyển sang các môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA
3
và IAA với
các nồng độ khác nhau. Hiệu quả kéo dài chồi được đánh giá thông
qua tỷ lệ mẫu kéo dài chồi và chất lượng chồi sau kéo dài cho thấy,

17
khi môi trường chỉ có mặt GA
3
, tỷ lệ mẫu kéo dài chồi cũng như số
chồi kéo dài/cụm tăng lên ở cả 2 giống đậu tương. Tuy nhiên cũng
nhận thấy rằng chất lượng chồi giảm theo sự tăng nồng độ GA
3
bổ
sung vào môi trường. Như vậy, căn cứ vào kết quả thu được trên
Hình 3.23. Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hin
gen gus trên cây đậu tương chuyển gen A, B: lá mm hạt non; C,
D: mảnh lá; A, C: cây không chuyển gen; B, D: cây chuyển gen;
E: cây đậu tương mang gen gus

Từ các kết quả nghiên cứu chuyển thành công gen gus ở giống
đậu tương ĐT12 và DT84, chúng tôi đã đề xuất quy trình hoàn chỉnh
cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông
qua phương pháp nách lá mm ở sơ đồ hình 3.24.

19
(bổ sung 2 mg/l BAP + 50 mg/l kanamycin)
Cắt bỏ lá mm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM
(bổ sung 0,5 mg/l GA
3
+ 0,1 mg/l IAA + 50 mg/l kanamycin)
Ra rễ trên RM
(bổ sung 0,1 mg/l IBA)
4-5 ngày
5 ngày
2 tun
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khun A. tumefaciens

Cảm ứng tạo chồi trên SIM ln 2
(bổ sung 2 mg/l BAP + 75 mg/l kanamycin)
2 tun
2 tun/ln
14-20 ngày

20
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương
Trong hai vector chuyển gen đã thiết kế thành công (p201-
SLHEP-HA và vector p201- SLHEP-HA1) chúng tôi chọn cấu trúc
vector p201- SLHEP-HA1 mang đoạn gen HA1 chuyển vào giống
đậu tương ĐT12. Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ
hợp mang cấu trúc p201- SLHEP-HA1 vào nách lá mm đã tổn
thương của giống đậu tương ĐT12 theo quy trình đã được tối ưu. Thí
nghiệm chuyển đoạn gen HA1 vào giống đậu tương ĐT12 được tiến
hành với 650 mẫu, thu được 65 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc

Hình 3.27. Phân tch cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen
HA1 ở thế h T
0
(M: Thang DNA chun 1kb;( -): Đối chứng âm;
WT: Cây không chuyển gen; 1 – 8: Các dòng T
0
được phân tch;
(+): Đối chứng dương (plasmid)
3.3.2. Phân tch các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế h T
1
Sử dụng lá non của 8 dòng cây đậu tương chuyển gen theo
dõi ở thế hệ T1 để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của đoạn
gen HA1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả trong 8
dòng cây phân tích ở thế hệ T1 chỉ có 2 dòng cây cho hạt là H11 và H4
(T
2
). Thu mẫu lá của hai dòng đậu tương chuyển gen H11 và H4 để 22
tách chiết DNA, kiểm tra đoạn gen HA1 bằng PCR với cặp mồi XhoI-
HA1/HindIII-HA1, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại
gen chuyển HA1 được trình bày ở hình 3.28.
1,25kb Hình 3.28. Phân tch sản phm PCR bằng cặp mồi đặc hiu XhoI-

Hình 3.29. Hình ảnh protein HA1 hin phim được phân tch bằng
Western blot t protein tổng số tách chiết t hạt của dòng đậu
tương H11 chuyển gen
(M: Thang protein chun; (-): cây không chuyển gen; 1-2: các
mu hạt thu được của cây đậu tương H11)

Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.29 cho thấy protein
HA1 được phát hiện ở kích thước khoảng 40kDa, tương ứng với kích
thước của protein HA1 theo tính toán lý thuyết. Từ kết quả lai
Western chúng tôi đã dự đoán protein tái tổ hợp HA1 biểu hiện trong
hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 có hàm lượng thấp, tuy
nhiên, chúng tôi chưa định lượng được loại protein tái tổ hợp HA1
này, vì thế cn phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá mức
độ biểu hiện của protein tái tổ hợp HA1 trên hạt đậu tương chuyển
gen. Trong thực tế để có đủ nguồn vật liệu phục vụ đánh giá khả
năng đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm cn có những
nghiên cứu nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen HA1 trong hạt với
mục đích thu được protein tái tổ hợp có hàm lượng cao.
M – 1 2
35kDa
55kDa