ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
THẠCH THÀNH TRUNG
KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA
ech42 Ở TRICHODERMA SP.
Chuyên ngành: HÓA SINH
Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG
Thành Phố Hồ Chí Minh - 2010
L
LL
LỜI CA
kiện tốt nhất cho con được học hành, là chỗ dựa tinh thần và luôn động viên con
những lúc khó khăn nhất. Con luôn tự hào khi mình có một gia đình như thế./.
Thạch Thành Trung
MỞ ĐẦU
Vi nấm Trichoderma là một tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng. Chúng có
khả năng đối kháng với một phổ rộng nấm gây bệnh cây trồng với nhiều cơ chế
khác nhau như kí sinh nấm, tiết chất kháng nấm, cạnh tranh dinh dưỡng, bảo vệ và
kích thích hệ rễ phát triển…Một trong những cơ chế quan trọng nhất là sự kí sinh
nấm dựa vào việc tiết hệ enzyme phân giải vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng như
chitinase, β-glucanase, cellulase, protease
Hệ chitinase, đặc biệt là nhóm endochitinase, một trong những yếu tố chính
trong cơ chế kí sinh ở Trichoderma vì sự cảm ứng đa dạng, thường xuyên hơn
những nhóm còn lại trong toàn hệ enzyme phân giải vách tế bào nấm. Một trong
những endochitinase được nghiên cứu chi tiết là endochitinase 42 kDa cùng với
gene mã hóa tương ứng, ech42. Chúng được cảm ứng một cách mạnh mẽ trong suốt
quá trình tương tác giữa Trichoderma với phổ rộng nấm gây bệnh. Những nghiên
cứu gần đây đã chứng minh rõ hơn vai trò quan trọng của ech42 trong sự đối kháng
của Trichoderma với nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng. Tuy nhiên, những nghiên
cứu về sự cảm ứng endochitinase 42 kDa và sự biểu hiện ech42 ở các chủng
Trichoderma phân lập tại Việt Nam vẫn còn khá hạn chế.
Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xác định sự hiện diện của endochitinase
42 kDa và khảo sát sự biểu hiện gene ech42 ở chủng Trichoderma sp. được phân
lập tại Việt Nam khi được nuôi cấy cảm ứng với chitin huyền phù hoặc vách tế bào
nấm gây bệnh thực vật. Từ đó có thể đánh giá mối quan hệ giữa sự biểu hiện ech42
ở mức mRNA và hoạt tính endochitinase.
1.3. Endochitinase 42 kDa và ech42 ở Trichoderma 16
1.3.1. Các nghiên cứu ở mức độ protein 17
1.3.2. Các nghiên cứu ở mức độ gene 18
Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên vật liệu 21
2.1.1. Chủng vi nấm dùng trong thực nghiệm 21
2.1.2. Cơ chất 21
2.2. Thiết bị 21
2.3. Môi trường nuôi cấy 22
2.4. Phương pháp 23
2.4.1. Phương pháp điều chế chitin huyền phù 1% 23
2.4.2. Phương pháp điều chế CM-chitin 23
2.4.3. Phương pháp thu nhận vách tế bào sợi nấm 24
2.4.4. Phương pháp đo đường kính vòng phân giải 25
2.4.5. Quy trình nuôi cảm ứng 25
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 26
2.4.6.1. Xác định hoạt độ chung chitinase 26
2.4.6.2. Phương pháp xác định hoạt độ chung endochitinase 28
2.4.7. Phương pháp điện di SDS-PAGE 28
2.4.8. Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein sau điện di
SDS PAGE 30
2.4.9. Phương pháp điện di native-PAGE 31
2.4.10. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 32
2.4.11. Thiết lập phản ứng RT-PCR 33
2.4.12. Thiết lập phản ứng PCR 33
2.4.13. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 34
2.4.14. Thiết lập phản ứng real-time PCR 35
2.4.15. Phương pháp 2
-∆∆Ct
35
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số cơ chất ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp của chitinase 11
Bảng 1.2. Một số hợp chất vô cơ và hữu cơ ảnh hưởng lên hoạt tính chitinase 12
Bảng 1.3. Một số gen mã hóa và enzyme tương ứng trong hệ chitinase
ở Trichoderma spp. được nghiên cứu chi tiết [42] 13
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma 37
Bảng 3.2. Các thông số lí thuyết của 2 cặp mồi 52
Bảng 3.3. Thông số của hai mẫu dò được thiết kế 55
Bảng 3.4. Giá trị Ct của hai gene tại các độ pha loãng khác nhau 58
Bảng 3.5. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum
TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa chitin huyền
phù 1,0% 59
Bảng 3.6. Mức độ biểu hiện tương đối của ech42 khi chủng T. longibrachiatum
TD16 được nuôi cảm ứng trong môi trường SM chứa vách tế bào
nấm S.rolfsii 0,5% 59
Bảng 3.7. Mức biểu hiện mRNA ech42 và HđC endochitinase theo thời gian
nuôi cấy trong dịch canh trường SM 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Hình 1.1. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma harzianum 1
Hình 1.2. Quá trình kí sinh của Trichoderma trên nấm gây bệnh R. solani 4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của gliovirin phân lập từ Trichoderma sp 6
Hình 1.4. Sự tác động đồng thời của chitinase và peptaipol từ
Trichoderma sp. lên vách tế bào nấm 6
Hình 1.5. Sự kích thích tăng trưởng hiệu quả đối với ớt, rau diếp và cà chua khi
có sự hiện diện của Trichoderma spp. so với không có (control) 8
Hình 1.6. Vị trí cắt của ba nhóm enzyme thuộc hệ chitinase 10
Hình 1.7. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hoá endochitinase 42 kD được
biến nạp từ T. harzianum có khả năng kháng nấm gây bệnh
A.alternata và R.solani 17
Hình 1.8. Endochitinase từ chủng T.atroviride 7-121 khi được nuôi cảm ứng
với 3 vách tế bào nấm khi xác định bằng phương pháp native-PAGE.
(1) B.cinerea, (2) A. alternata, (3) F.oxysporum 18
Hình 1.9. Sự cảm ứng chitinase trong môi trương MM chứa lần lượt chitin và
glucose bởi T. harzianum. (A) Hoạt tính chitinase, chitin,
glucose ; (B) Kết quả Northern blot với mẫu dò ech42 ; (C) Kết quả
Northern blot với mẫu dò gen chứng 5S rRNA 20
Hình 3.1. Các băng protein trên gel polyacrylamide sau khi chạy native-PAGE
nhuộm comassive brilliant blue (giếng 1) và nhuộm cơ chất đặc
hiệu endochitinase trên gel agarose (giếng 2) tương ứng hình A-
protein thu nhận khi cảm ứng bởi chitin huyền phù (chi), hình B-
protein thu nhận khi cảm ứng bởi vách tế bào nấm S. rolfsii (SR) 45
Hình 3.2. Kết quả SDS-PAGE hai isozyme endochitinase. Cơ chất cảm ứng là
chitin huyền phù 1% (Chi1 và Chi2) và vách tế bào nấm S. rolfsii
0,5% SR1 và SR2) cùng với mẫu thô tương ứng (Chi và SR) 46
Hình 3.3. Kết quả SDS-PAGE hai mẫu tủa protein thu được từ dịch môi trường
SM chứa chitin huyền phù 1% (Chitin) hay vách tế bào nấm S.
rolfsii 0,5% (SR) cùng với thang trọng lượng phân tử thấp (LMW) 50
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân bản của hai cặp mồi cho gene 18S
T05 3,8 3,9 3,7 TD27 1,6 1,8 -
T07 4,6 4,6 4,8 TD30 1,1 1,2 1,1
T08 5,0 4,7 4,9 TD31 1,8 2,0 -
T09 4,4 4,1 4,6 TD32 1,6 1,8 1,5
T10 3,6 3,3 3,4 TD33 1,2 1,3 -
T11 1,2 1,1 1,0 TD34 4,4 4,2 4,2
T12 1,5 1,6 1,5 TD35 5,0 5,2 4,9
T13 4,2 4,3 4,2 TD41 1,0 1,2 1,2
T14 4,0 3,5 3,7 TN01 1,0 0,8 0,7
T15 1,4 1,2 - TN03 1,1 1,2 1,2
T16 2,3 2,6 2,5 TN04 2,1 2,1 1,9
T17 2,5 2,9 - TN06 0,7 0,4 0,5
T18 0,8 0,9 1,0 TN07 5,0 5,2 5,3
T20 0,8 0,8 1,0 TN08 - 2,1 1,9
TD01 5,9 5,9 5,7 TN09 1,2 1,4 1,1
TD04 1,4 1,4 - TN10 2,1 2,0 2,2
TD05 1,1 1,1 1,1 TN11 - 1,4 1,7
TD06 0,8 1,1 1,1 TN12 1,8 1,7 2,2
TD07 0,9 0,9 1,0 TN14 1,7 1,8 1,8
TD08 1,0 1,3 1,0 TN15 1,7 1,7 -
TD09 1,0 1,1 1,1 TN16 1,2 1,5 1,2
TD10 1,0 1,1 - TN17 2,3 2,5 -
TD11 3,0 3,1 3,0 TN18 1,4 1,2 1,3
TD12 2,1 2,0 1,8 TN20 2,4 2,5 2,4
TD13 4,7 4,4 4,5 TN21 2,4 2,3 2,3
TD16 5,7 5,7 5,8 TN23 3,7 3,9 -
TD17 2,9 3,1 3,1 TN24 1,9 2,0 2,3
TD18 2,1 2,1 2,0 TN25 2,3 2,2 2,5
TD19 1,1 1,3 - TN26 3,7 4,0 -
TD20 3,0 3,0 - TN29 1,9 2,0 -
2,586 ± 0,517
3,966 ± 0,793 1,896 ± 0,219 3,103 ± 0,358
4 1,379 ± 0,159 4,828 ± 0,557 2,069 ± 0,119 3,620 ± 0,209
5 1,034 ± 0,060
6,035 ± 0,348
3,103 ± 0,310 3,793 ± 0,379
6 0,517 ± 0,060 4,311 ± 0,498
5,172 ± 0,896
4,655 ± 0,806
7
0,172 ± 0,010 3,276 ± 0,189
3,620 ± 0,362
5,689 ± 0,569
8
1,724 ± 0,263 5,000 ± 0,764
HđC
endochitinase
(đvht/ml) 0,5% 1,0% 1,5% 2,0%
Ngày
2,69 ± 0,62 3,84 ± 0,80 1,90 0,02 2,73 ± 0,39
1 4,86 ± 0,60
5,88 ± 1,11 3,21 ± 0,09 4,98 ± 0,17
2
5,62 ± 1,61
9,54 ± 2,07
4,62 ± 0,24 5,60 ± 0,09
3 2,47 ± 0,37
1,58 ± 0,04
Vách tế bào nấm
S. rolfsii
Vách tế bào nấm
P. capsici
HđC CHITINASE (đvht/ml)
NGÀY
0,5% 1,0% 1,5% 0,5% 1,0% 1,5%
1
0,344 ±
0,019
0,344 ±
0,020
0,172 ±
0,010
0,170 ±
0,010
0,172 ±
0,010
0,345 ±
0,20
2
1,551 ±
0,089
0,862 ±
0,132
0,345 ±
0,053
0,862 ±
5
3,448 ±
0,868
1,724 ±
0,172
1,034 ±
0,103
3,103 ±
0,310
1,379 ± 0
2,241 ±
0,342
6
2,241 ±
0,721
1,379 ±
0,239
1,379 ±
0,239
1,896 ±
0,438
0,689 ±
0,039
2,069 ±
0,948
7
1,034 ±
0,158
1,034 ±
0,103
0,01
2
4, 85 ±
0,06
2,38 ±
0,02
1,90 ±
0,13
5,00 ±
0,19
2,81 ± 0,11
3,90 ±
0,04
3
6,55 ±
0,12
4,61 ±
0,64
2,98 ±
0,19
6,00 ±
0,63 5,08 ± 0,23
5,59 ±
0,04
4
9,59 ±
0,59
7,10 ±
0,24 2,08 ± 0,07
7,69 ±
0,14
7 2,56 0,14
3,81 ±
0,47
2,55 ±
0,19
4,00 ±
0,15
1,24 ± 0,06
3,20 ±
0,04
8
1,02 ±
0,43
1,37 ±
0,17
2,08 ±
0,06
2,00 ±
0,15
Bảng 6.5. HđC chitinase và endochitinase của chủng T. longibrachiatum TD16
trong dịch môi trường SM chứa chitin và vách tế bào nấm S. rolfsii
0,3 ±
0,071
0,75 ±
0,036
0,45 ±
0,024
96
0,7 ±
0,014
0,5 ±
0,048
0,2 ±
0,014
0,2 ±
0,024
0,425 ±
0
0,4 ±
0,014
HđC ENDOCHITINASE (đvht/ml)
T.gian (giờ) 0,5% 1,0% 1,5% 0,25% 0,5% 1,0%
0 0 0 0 0 0 0
24
1,02 ±
0,06
1,25 ±
0,13
0,55 ±
0,02
3,02 ±
0,11
96
0,89 ±
0,14
0,89 ±
0,10
0,49 ±
0,03
0,76 ±
0,17
0,87 ±
0,19
0,97 ±
0,05
Bảng 6.6. Đường chuẩn thang protein (cat# 161-0317)
S (mm) Lg X Marker (kDa) Lg M
3 0,477121
200 2,30103
7 0,845098
116,25 2,065393
9 0,954243
97,4 1,988559
2
= 0.9949
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00
Đồ thị 6.1. Đường chuẩn thang protein
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8
Nồng độ D-
glucosamine
(µg/ml)
0 10 20 30 40 50 60 70
OD
TB
0,388
0,413 0,451 0,489 0,506 0,532 0,559 0,589
OD
TB
0 0,025 0,063 0,093 0,118 0,144 0,171 0,201 Đồ thị 6.2. Đường biểu diễn sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ
Mẫu 0
0
11,65 13,66 12,12
24
16,09 17,32 17,01
48
16,63 15,81 16,73
72
13,7 19,35 16,83
Chitin
96
14,82 21,33 21,21
24
12,43 13,74 13,29
48
14,84 15,35 14
72
15,51 15,65 16,84
18S rRNA
Vách tế
bào nấm
S. rolfsii
96
16,08 16,09 16,82
Mẫu 0
0
24,57 26,14 24,17
24
27,5 28,06 28,41
chitin 1,0% ở thời điểm 48 giờ.
Hình 6.4. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
chitin 1,0% ở thời điểm 72 giờ.
Hình 6.5. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
chitin 1,0% ở thời điểm 96 giờ. Hình 6.6. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
vách tế bào nấm 0,5% ở thời điểm 24 giờ. Hình 6.7. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
vách tế bào nấm 0,5% ở thời điểm 48 giờ. Hình 6.8. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
vách tế bào nấm 0,5% ở thời điểm 72 giờ.
Hình 6.9. Giá trị Ct của gene 18S rRNA và ech42 của mẫu cảm ứng trên
vách tế bào nấm 0,5% ở thời điểm 96 giờ.
DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỐ THỊ
Biểu đồ 3.1. HđC chitinase của năm chủng Trichoderma sp 39
Đồ thị 3.1. Biến thiên HđC endochitinase cùng với chitinase theo thời gian nuôi
Trong những thập kỉ gần đây, số lượng loài Trichoderma spp. được phát hiện đã
tăng lên đến cả trăm loài [41] cùng với các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại
vẫn chưa được tìm hiểu và phân tích đầy đủ. Do đó Trichoderma là một trong
những giống vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại.
Những phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí,
sinh hóa có vẻ còn mơ hồ, dễ mắc những sai lầm trong phân loại. Dựa vào việc
phân tích trình tự của một số gene đặc trưng như ITS, tef, rpb hay ech42,
Druzhinina S.I. và cs (2006) đã phân loại Trichoderma như sau: [12],[41]
Giới Fungi
Ngành Ascomycota
Lớp Euascomycetes
Bộ Hypocreales
Họ Hypocreaceae
Chi Trichoderma
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa
Trichoderma là một loại nấm sợi, sống tự do, hoại sinh, thường thấy trong hệ
sinh thái rễ, xác bã thực vật, những nơi ẩm ướt, trên phân thú vật và cả trên sáp,
thép không rỉ, đặc biệt là có nhiều trong đất, có thể cộng sinh với thực vật và là sinh
vật ký sinh trên các loài nấm khác [15], [41]. Trichoderma phát triển tốt trên đất có
tính acid và có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên đất có pH kiềm nếu như có sự
tập trung một lượng CO
2
và bicarbonat thích hợp.
Trichoderma mang bào tử đính, cuống mang bào tử phân nhánh, ở cuối nhánh
phát triển thành một khối tròn gọi là thể bình mang các bào tử trần màu lục, liên kết
Hình 1.1. Khuẩn ty (a) và cơ quan sinh bào
Chet I. và cs (1998) đã chứng minh rằng Trichoderma có thể nhận diện kí chủ
của nó từ rất xa. Chúng bắt đầu mọc nhánh một cách không bình thường, với các
nhánh mọc hướng về phía các loài nấm mục tiêu. Mặc dù Trichoderma có vẻ mọc
theo một gradient hóa học, nhưng chỉ có các amino acid và đường (các tác nhân
kích thích chuyên biệt) là cảm ứng cho sự tăng trưởng này. Tính mọc hướng hóa
học có ảnh hưởng nhất định cho các tác nhân đối kháng [6].
Copyright: Tài liệu đại học ©