Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ KIM DUNG XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA
GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG
VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Đặng Xuân Bình
Thái Nguyên, năm 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện
cùng với sự giúp đỡ của TS. Đặng Xuân Bình. Các số liệu, hình ảnh và kết quả
trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công
trình nào khác. Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã
được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Ở Việt Nam 4
1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng 5
1.3. Mầm bệnh 10
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu 11
1.3.2. Đặc tính nuôi cấy 12
1.3.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida 15
1.3.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 16
1.3.5. Serotype của vi khuẩn P. multocida 18
1.3.6. Độc lực của vi khuẩn P. multocida 21
1.3.7. Sức đề kháng 22
1.4. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây nên 23
1.4.1. Cơ chế sinh bệnh 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.2. Biể u hiệ n đặ c trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng 23
1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh 25
1.5.1. Một vài nét về lịch sử phát triển của vắc xin 25
1.5.2. Thành phần của vắc xin 26
1.5.3. Công nghệ lên men vi khuẩn trong chế tạo vắc xin 30
1.5.4. Phân loại vắc xin 30
1.5.5. Vắc xin tại chỗ (autovaccine) 33

2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 43
2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin 43
2.4.6. Phương phá p xử lý số liệ u 45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46
3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng
từ năm 2006 – 2009 46
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 47
3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ
năm 2006 – 2009 48
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ 50
3.1.4. Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 53
3.1.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia
súc khoẻ tại tỉnh Cao Bằng 54
3.1.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch
theo lứa tuổi 56
3.1.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của các
chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại một số huyện
có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng 58
3.1.8. Xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida bằng phương
pháp PCR (Polymerase chain reaction) 59
3.1.9. Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được 59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.1.10. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn Pasteurella
multocida phân lập được với một số loại kháng sinh 61
3.2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò 62
3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin 62
3.2.2. Xác định liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) 64
3.2.3. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine 65
3.2.4. Kiểm tra an toàn và hiệu lực của autovaccine trên động vật thí nghiệm 66

C/24h : Bồi dưỡng trong tủ ấm 37
0
C trong 24 giờ + Chú thích
CB6: Mẫu nghiên cứu số 6 tại Cao Bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida 11
Bảng 1.2. Hệ thống phân loại P. multocida 20
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao
Bằng từ năm 2006 – 2009 47
Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại tỉnh Cao
Bằng từ năm 2006 - 2009 49
Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ 51


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là bệnh truyền nhiễm thường diễn biến cấp
tính, xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi gia súc. Hàng năm, trên địa bàn các tỉnh miền
núi phía Bắc nước ta, các báo cáo của cơ quan thú y địa phương về tình hình
bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở trâu, bò đã cho thấy những thiệt hại kinh tế to lớn.
Để phòng bệnh, cho đến nay có nhiều loại vắc xin tụ huyết trùng trâu,
bò được các cơ quan nghiên cứu chế tạo, sử dụng tiêm phòng cho gia súc mẫn
cảm nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra. Vấn đề đặt ra là cần phải tiếp tục xác định,
làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh của
mầm bệnh để sản xuất và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế
tiến tới thanh toán bệnh (Đinh Duy Kháng và cs, 2000) [13].
Về đáp ứng miễn dịch của một số loại vắc xin hiện đang được sử dụng
phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở nước ta, Hoàng Xuân Nghinh và cs
(2004) [21] trao đổi: Hiện nay, ở Việt Nam có hai loại vắc xin sản xuất trong
nước đang được các địa phương sử dụng. Tuy nhiên, tỷ lệ trâu bò mắc bệnh
và chết vẫn không giảm, vì vậy chúng ta phải suy nghĩ xem có phải chất
lượng kháng nguyên trong vắc xin chưa được chuẩn hoá hay đặc tính kháng
nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida ở mỗi vùng có sự khác nhau. Do
vậy, việc xá c đị nh vi khuẩ n Pasteurella multocida gây bệnh tại ổ dịch từ đó
lự a chọ n kháng nguyên phù hợp chế tạo vắc xin tại chỗ sẽ là một trong những
biện pháp có ý nghĩa góp phần giải quyết các vấn đề nêu trên đáp ứng yêu cầu
kiểm soát bệnh hiệu quả tại các tỉnh miền núi phía Bắc.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn của ngành chăn nuôi trâu bò các
tỉnh thuộc miền núi phía bắc, trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu của các
tác giả đi trước ở trong và ngoài nước. Căn cứ vào khả năng của cơ sở sản
nghiên cứu, điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, chúng tôi đề xuất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nƣớc
1.1.1. Trên thế giới
Theo De Alwis (1992) [47], bệnh tụ huyết trùng được Bollinger phát
hiện đầu tiên năm 1878 ở Munich (Đức) và năm 1885, Kitt phân lập được vi
khuẩn gây bệnh. Năm 1880, Pasteur phát hiện vi khuẩn gây bệnh cho gà (Fowl
Cholera), bệnh ở lợn do Loeffer phát hiện năm 1886. Cùng năm 1886 nhận
thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh và có sự tương đồng về vi khuẩn gây
bệnh phân lập từ các loài động vật nói trên, Hueppe gọi chung là vi khuẩn gây
nhiễm trùng huyết, xuất huyết và đặt tên là Bacillus septicaemia. Năm 1887,
Oreste và Annani đã mô tả một bệnh ở trâu do một loại vi khuẩn tương tự gây
ra và gọi đó là bệnh ―Barbone‖ (De Alwis, 1992) [47].
Để ghi nhớ công lao của Luis Pasteur, người có nhiều đóng góp
nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn này, năm 1887 Trevisan đã đề nghị đặt
tên cho vi khuẩn là Pasteurella (De Alwis, 1992) [47]. Do Pasteurella gây
bệnh cho nhiều loài gia súc nên tên của vi khuẩn, theo những năm trước đây
được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh:
Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn
Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò
Pasteurella oviseptica gây bệnh ở dê, cừu
Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà…
Sau đó, tên của vi khuẩn còn một vài lần nữa được thay đổi và đến
năm 1939, Rosenbush và Merchant (1939) [75] đề nghị đặt tên cho vi khuẩn

về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên
nhiều, hàng năm có 20 – 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành.
Ở nước ta khí hậu nóng ẩm, mỗi miền Bắc – Trung – Nam có điều
kiện khí hậu và hệ sinh thái khác nhau. Các tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
1978 [24], Nguyễn Ngã, 1996 [20], Nguyễn Thiên Thu, 1996 [32]) đã nhận
định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với những cơn mưa ở
từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa.
Ngoài các đặc điểm dịch tễ, nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu
đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn P. multocida, phương pháp chẩn đoán,
phân lập và chế tạo vắc xin phòng bệnh.
Phan Thanh Phượng (1986 – 2000) [27] tiến hành nghiên cứu, chế tạo
và sử dụng vắc xin nhũ hoá bằng công nghệ lên men sục khí để phòng chống
bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ.
Dương Thế Long (1995) [17] đã phân lập được vi khuẩn P. multocida
gây bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La.
Nguyễn Ngã (1996) [20], Nguyễn Thiên Thu (1996) [32] đã phân lập
được vi khuẩn P. multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và
xác định tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập
được với chủng vắc xin Iran.
Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) [7] tiến hành nghiên cứu một
số đặc tính của vi khuẩn P. multocida phân lập từ trâu, bò, lợn.
1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng
- Loài vật và tuổi mắc bệnh:
Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú hoang dại
và chim đều mẫn cảm với bệnh. Theo Lignieres (1900) [58] ít nhất có 6 dạng
bệnh khác nhau: ở gà, cừu, trâu, bò, lợn, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh này đều

Yeo và Mukhtar (1992) [79] theo dõi dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu,
bò ở đảo Sabah, Malaysia từ 1983 – 1991 cho biết số lượng ổ dịch và số
lượng trâu, bò chết hàng năm ở các huyện rất khác nhau: Một số huyện xảy ra
dịch từ tháng giêng đến tháng 3, trong khi phần lớn lại xảy ra dịch từ tháng 7
đến tháng 11. Từ số liệu theo dõi của mình, tác giả đã so sánh giữa 2 vùng
trong cùng một đất nước về loài vật mắc bệnh, tuổi mắc bệnh, thời gian xảy ra

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
bệnh và cho rằng sở dĩ có sự khác nhau này là do điều kiện thời tiết khí hậu
có sự khác nhau giữa 2 vùng, đồng thời phương thức chăn nuôi giữa 2 vùng
cũng khác nhau. Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy tại từng địa
phương, từng quốc gia khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu,
bò phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng, vì
những yếu tố này ảnh hưởng tới sự tồn tại, phát triển của mầm bệnh trong môi
trường sinh sống của động vật cảm nhiễm.
Ở nước ta bệnh xuất hiện khắp nơi, có khi chỉ là những ổ dịch nhỏ, lác
đác. Nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm thì bệnh lây lan thành
dịch, bởi nhiệt độ, ẩm độ của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát
triển của mầm bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [24]. Đặc biệt là sau những
trận mưa đầu mùa mang đến những thay đổi về sức khoẻ do gia súc bị lạnh, ở
những vùng ngập lụt, sau khi nước rút đi, cỏ bị ô nhiễm nên bệnh thường phát
sinh vào các tháng có mưa nhiều và chuyển mùa. Đoàn Thị Băng Tâm (1987)
[30], Dương Thế Long (1995) [17], Nguyễn Xuân Bình (1996) [1], Nguyễn
Thiên Thu (1996) [32], Đỗ Quốc Tuấn (2008) [34] đều cho rằng vào thời gian
mưa, bệnh xảy ra nhiều hơn. Bùi Quý Huy (1998) [10] cho biết ở miền Bắc
bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào các tháng mưa nhiều từ tháng 7
đến tháng 9, ở miền Nam, bệnh xảy ra mạnh sau khi mưa và nắng từ tháng 4
đến tháng 10 (từ tháng 7 đến tháng 9, số ổ dịch chiếm tới 78% số ổ dịch trong

đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùng đồng bằng.
Ở những vùng mà phương thức chăn nuôi còn thả rông, không có
người chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùn
lầy, ngập nước, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng kém thì khả năng xảy ra bệnh
cao. Ngoài ra, trình độ dân trí thấp, nhận thức của người dân về công tác
phòng chống bệnh chưa cao, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc
phòng chống dịch bệnh còn nhiều khó khăn… cũng không tránh khỏi việc
dịch bệnh thường xuyên xảy ra.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
- Cách lây lan
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [15], bệnh tụ huyết trùng trâu bò lây
truyền theo các con đường sau: Bệnh trực tiếp lây lan từ súc vật bệnh sang súc
vật khỏe thông qua tiếp xúc, chung đụng dụng cụ chăn nuôi, nguồn thức ăn,
nước uống, nhốt cùng chuồng, chăn cùng bãi chăn thả.
Bệnh có thể lây lan xa do việc mổ thịt súc vật ốm, phân tán thịt, da.
Chó, mèo, chuột và một số côn trùng hút máu như ruồi, mòng… cũng có thể
là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa.
- Hiện tượng mang vi khuẩn P. multocida ở đường hô hấp trên của
động vật khoẻ
Từ khi phát hiện bệnh tụ huyết trùng do P. multocida gây ra đến nay
đã hơn 100 năm, có khá nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn P.
multocida, về bệnh học Pasteurellosis và vắc xin tiêm phòng nhưng vẫn
không loại trừ và thanh toán được bệnh, đặc biệt là những nước nhiệt đới,
bệnh tụ huyết trùng vẫn là mối đe doạ người chăn nuôi.
Hiện tượng mang vi khuẩn P. multocida ở động vật đã được nhiều nhà
khoa học nghiên cứu. Mustafa và cs (1978) [60] đã tiến hành lấy dịch ngoáy
mũi trâu, bò để phân lập P. multocida và có nhận xét: Thường ở nơi không có

- Họ (family) Parvobacteriaceae
- Tộc (tribe) Pasteurellaceae
- Giống (genus) Pasteurella
- Loài (species) Pasteurella multocida
Trước đây Pasteurella multocida có tên là Pasteurella boviseptica,
Pasteurella suiseptica, Pasteurella aviseptica,… tùy thuộc vào ký chủ đầu
tiên của vi khuẩn phân lập được. Và cuối cùng tên gọi đã được thống nhất là
Pasteurella multocida. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida
Tác giả
Năm
Tên

Bollinger
Pasteur
Burril
Zopf
Kitt
Oreste and Armani
Trevisan
Lehmann and Neumann
Stemberg
Lignieres
Bacterium multocidium
Bacterium septicaemia haemorrhagicae
According to host species:
Pasteurella aviseptica
Pasteurella boviseptica
Pasteurella suiseptica
Etc
Pasteurella septica
Pasteurella multocida Nguồn: Namioka (1978) [62].
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu
P. multocida là vi khuẩn Gram âm , có dạng cầu trực khuẩn nhỏ , hình
trứng hoặc hình bầu dục , với kích thước vào khoảng : 0,25-0,4 x 0,4-1,5 µm.
Mứ c độ đa hì nh thá i củ a P. multocida cũng cần được chú ý trong các canh
khuẩ n già : Vi khuẩ n có dạ ng trự c khuẩ n vớ i chiề u dà i rấ t khá c nhau và có sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
thay đổi ở các loài ký chủ khác nhau 0,5–1 × 1–2 µm (lợn), 0,2—0,4 x 0,6—
2,5µm (gia cầm).
Theo Carter (1967) [43] có mối liên quan về tính đa dạng của vi khuẩn
khi phát triển trong điều kiện thiếu O
2
. Vi khuẩn thường đồng nhất trong máu
động vật. Trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình dạng, hình
trứng, hình cầu Tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy nhiều lần trong môi
trường nhân tạo, chiều dài của vi khuẩn tăng lên.

(1952) [39] mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển nhanh, để lâu mùi tanh
giảm dần (trong môi trường nước thịt P. multocida phát triển theo 4 pha: Pha
chậm, pha phát triển nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái).
Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S,
nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu khuẩn lạc có
màu trắng ngà dính vào môi trường.
Theo Carter (1955) [40], Namioka và Murata (1961a, b) [63], [64]
trên môi trường thạch P. multocida tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Có rìa gọn, bóng láng, có dung quang
mạnh và có độc lực mạnh.
+ Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Nhầy, ướt, có kích thước lớn nhất, bề
mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, độc lực trung bình.
+ Khuẩn lạc R (Rough): Có rìa xù xì, thường không có dung quang,
độc lực yếu.
Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi cấy chuyển qua môi
trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật. Từ dạng S chúng có thể
chuyển sang dạng R hoặc M và ngược lại. Tính biến dạng này đặc biệt rõ khi
nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng có các loại đường mà chúng
lên men. Trong những môi trường đó chúng xếp thành từng chuỗi.
Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: Vi khuẩn phát
triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi
trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước
dãi khô rất đặc trưng cho vi khuẩn tụ huyết trùng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
Theo Namioka và Murata (1961c) [65] YPC (Yeast extract Pepton - L
- Cystin) có thêm Sucrose và Sodium sulfite là môi trường nuôi cấy tốt nhất
cho vi khuẩn P. multocida, môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi