BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TIẾN NAM

NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH
TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN
XUấT ðƯờNG XYLOSE
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. NGUYỄN VĂN GIANG
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
2. TS. NGUYỄN TẤT THẮNG
Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch
bản luận văn này.
ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn TS. Nguyễn Tất Thắng - Viện cơ ñiện
nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi
ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa
công nghệ sinh học, Viện ñào tại sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả

Nguyễn Tiến Nam

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

MỤC LỤC
Trang

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
I. Đặt vấn đề 1
II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

3.4.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm 37
3.4.7. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase để thu nhận đường
xylose từ xy lan quy mô phòng thí nghiệm 41
3.4.8. Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi đường
xylose quy mô thí nghiệm 43
3.5. Phương pháp xử lý số liệu 44
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1. Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 45
4.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh
tổng hợp enzyme xylanase 45
4.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc An
NVT3 tuyển chọn 46
4.2. Nghiên cứu xác định một số điều kiện (nhiệt độ, pH, dinh dưỡng,
…) để sinh tổng hợp enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 48
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả nắng sinh tổng
hợp enzyme xylanase 48
4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase 49
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp xylanase 50
4.2.4. Xác định nguồn và nồng độ nitơ vô cơ thích hợp đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme xylanase 52
4.3. Nghiên cứu điều kiện thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thí
nghiệm 53
4.3.1. Cô đặc dịch xylanase bằng màng siêu lọc Amicon (PM10) 53
4.3.2. Nghiên cứu công nghệ tách chiết enzyme xylanase 54
4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt lực của enzyme

HPLC
l
ml
mg
RS
TS
V/ph
Xyl

Chữ viết thường
Aspergillus niger
Công nghiệp thực phẩm
gam
Sắc ký lỏng cao áp
lít
mililit
miligam
Đường khử
Đường tổng số
Vòng/phút
Xylose

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

Bảng 2.1. Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
xylanase 56

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme
xylanase 57

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme xylanase 58

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme
xylanase 59

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả
thủy phân dịch xylan 60

Bảng 4.14. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan lõi ngô 62

Bảng 4.15. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan 64

Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan 65

Bảng 4.17. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan 66

Bảng 4.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính đến hiệu quả tinh sạch
dịch đường sau thủy phân 68


1

PHẦN I. MỞ ðẦU
I. ðặt vấn ñề
Hiện nay trên thế giới nguồn thực phẩm chức năng đóng vai trò quan
trọng. Nó giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe, kéo dài tuổi
thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo nhất là trong giai đoạn hiện
nay, khi đời sống con người ngày càng tăng cao và yêu cầu về sức khỏe ngày
càng được xem trọng. Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm được chế biến
từ các nguyên liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và động vật giàu hoạt chất
sinh học. Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức
khỏe, kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo [10].
Những năm gần đây một loại đường chức năng đang có xu hướng gia
tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới với các ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm như là chất phụ gia, bổ sung vào đồ uống
dinh dưỡng, là nguyên liệu đầu của thuốc trổng hợp điều trị bệnh ung thư,
phòng chống một số bệnh (tiểu đường, mất ngủ, đường ruột…) đó là đường
xylose. Trong công nghiệp thực phẩm, xylose được sử dụng để sản xuất bánh
kẹo, dùng làm chất phụ gia thực phẩm và là sản phẩm được bổ sung vào các
loại đồ uống. Nhờ xylose có độ ngọt tương đương với đường sucrose và do
đặc điểm mất nhiệt khi hoà tan nên tạo cảm giác mát lạnh trong miệng. Đặc
tính này làm cho xylose rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, đặc
biệt là đồ uống. Trong lĩnh vực y dược, xylose được biết đến như một trong
những nguyên liệu đầu của việc tổng hợp thuốc trị bệnh ung thư, AIDS và
một số bệnh khác (Trương Thị Minh Hải và cs., 2008)[9]. Có 2 phương pháp
chính để sản xuất đường xylose là phương pháp hóa học và phương pháp lên
men nhờ vi sinh vật. Trong đó sản xuất xylose theo phương pháp lên men từ
xylan nhờ vi sinh vật tỏ ra có nhiều ưu điểm trong việc khắc phục các nhược
điểm của phương pháp hóa học.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng hợp enzyme
xylanse cao
Aspergillus là một chi nấm có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng
sản sinh nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào có giá trị công nghiệp, trong
đó có xylanase. Với khả năng sinh đồng thời nhiều loại enzyme thủy phân
ngoại bào (cenllulase, protease, pectinase, amylase, xylanse) nên đa số các
loài của chi nấm này đều có khả năng sinh mạnh xylanase trên nhiều cơ chất
tự nhiên khác nhau bao gồm cả các phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulo
trong đó có lõi ngô. Tuy nhiên khả năng sản sinh ra xylanase còn phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố như: chủng giống, chất lượng lõi ngô, nhiệt độ, pH, độ
ẩm,… Trong đó yếu tố đầu tiên đóng vai trò quyết định là chất lượng chủng vi
sinh vật. Chính vì vậy việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng
hợp enzyme xylanase cao là một vấn đề vô cùng cần thiết.
Trong quá trình nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp
xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp phục vụ chăn nuôi, từ 129 chủng vi
khuẩn và nấm sợi có nguồn gốc từ rừng ngập mặn, tác giả Phương Phú Công
(2009) đã tuyển chọn được chủng Aspergillus Gm56 có khả năng sinh mạnh
xylanase (đạt 485,05 IU/g khi lên men chìm và 1329,9 IU/g khi lên men rắn
với cơ chất lõi ngô. Enzyme xylanase được sinh ra từ chủng Gm56 có thể hoạt
động tốt và bền ở acid ở ngưỡng từ 2,0-6,0, nhiệt độ gần với hoạt động của bộ
máy tiêu hóa vật nuôi [6].
Tác giả Trần Hữu Phong (2007) [22] khi nghiên cứu một số đặc điểm
xylanase từ chủng Aspergillus niger ĐB106 cho biết chủng Aspergillus niger
ĐB106 có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân polysaccharide
(amylase, cellulase, xylanase, α-galactosidase), không sinh protease và

chất của xylanase có mối tương quan rất lớn đến các gốc hydro liên kết với
các xylanase. Nếu xylanase có tính bazơ thì amino axit là asparagines,
xylanase có tính axit thì amino axit là aspartic [30].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

2.2.1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:
Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách
thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.
Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc
tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian
đồng hóa trị enzyme - cơ chất.
Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động.
Phân tử nước này tách thành ion H
+
và OH
-
. Ion H
+
gắn vào gốc glycosyl vừa
được tách ra trong khi ion OH
-
gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra
theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng, đồng thời
enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.
Sơ đồ tóm tắt của quá trình như sau:
Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm
Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc được đặt vào vị trí đối diện với khe giữ
Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit

Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase đã
thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong đó các công trình
nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi
khuẩn [6].
* Enzyme xylanase từ vi khuẩn: Là một trong số rất nhiều enzyme
xylanase được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp. Trong số đó, chi
Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến đã
được công bố và sử dụng rộng rãi. Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt
động tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, ở nhiệt độ 50 - 80
o
C. Nakamura và cs khi
nghiên cứu enzyme xylanase của Bacillus sp. 41-1 cho thấy chúng hoạt động
tốt ở nhiệt độ 50
o
C [54].
* Enzyme xylanase từ nấm: Enzyme xylanase được sản xuất từ nấm
đặc biệt là các loại nấm sợi được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp. Khả
năng sinh enzyme xylanase của nấm sợi cao hơn nhiều so với khả năng sinh
enzyme xylanase của vi khuẩn và nấm men. Ngoài ra, nấm sợi thường sản
sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và
các enzyme phân cắt nhóm thế khác. Các enzyme xylanase của nấm sợi
thường là các enzyme ngoại bào. Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme
xylanase như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase
chủ yếu sản xuất từ nấm sợi. Đặc tính chung của đa số các xylanase từ nấm là
hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 35 - 50
o
C, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ
4,0 - 8,0 [5].
Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai
chi sinh enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt Aspergillus là

C/h)
IU/g khối
lượng
khô
A. fumigatus
4-45-IF
Rơm 81 40/96 545
A. niger
BS11042
Cám mỳ/Bột củ cải
(Tỷ lệ 4/1)
50 30/48 283
Cám mỳ/xylan
(Tỷ lệ 25/1)
60 28/336 724
A. ochraceus
Thân mỳ 60 28/336 448
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase
2.2.3.1. Tình hình sản xuất và thương mại enzyme xylanase
Những thành tựu nổi bật trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng
xylanase được sản xuất và ngày càng được sử dụng phổ biến. Trên thế giới có
khoảng 10 công ty sản xuất lớn và hàng loạt các công ty nhỏ sản xuất enzyme
công nghiệp, nhưng công ty của Novo- Nordisk của Đan Mạch là công ty sản
xuất enzyme lớn nhất trên thế giới. Chỉ tính đến năm 1994 họ đã sản xuất đến
32% enzyme tẩy rửa, chế biến các sản phẩm từ sữa 14%, dệt 10%, thuỷ phân
tinh bột 15% và các enzyme khác khoảng 29%. Nhưng thành tựu nổi bật nhất
trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase chính là các chế phẩm

(prebiotic) có cấu tạo từ 2 đến 7 phân tử đường β-xylose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4- β-xyloside. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm
cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khi được bổ sung vào cơ thể người,
prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng như ngăn cản quá trình gây
bệnh của vi khuẩn và các tác nhân gây tiêu chảy, tăng khả năng miễn dịch của
cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong
khoang miệng. Các sản phẩm phụ nông nghiệp như lõi ngô, cám gạo, vỏ trấu
là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất xylo-oligosaccharide. Các enzyme tốt
nhất sử dụng cho quá trình này là các enzyme từ nấm mốc. Hiện nay nhu cầu
về oligosaccharide trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về
oligosaccharide vào khoảng 1000 - 2000 tấn/năm [16].
2.2.3.3. Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi
Việc sử dụng enzyme xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự
quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn
của gà con làm giảm độ nhớt trong ruột gà, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của
gà con và kết quả là cải thiện đáng kể trọng lượng của chúng. Theo Feoli và
cộng sự thì việc bổ xung enzyme xylanase vào bột mì và bột đậu tương trong
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1
1

thức ăn gia súc với một tỷ lệ nhất định cải thiện được năng suất và khả năng
tiêu thụ thức ăn của lợn.
Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc bổ sung enzyme xylanase vào thức
ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ linh lăng, ngũ cốc ) đã làm tăng
hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [34].
2.2.3.4. Ứng dụng trong sản xuất bánh và các ứng dụng khác
Các enzyme xylanase có khả năng cải thiện chất lượng của bánh mì bởi
vì nó làm tăng thể tích của bánh. Chất lượng của bánh được cải thiện tốt hơn
khi sử dụng enzyme xylanase kết hợp với enzyme amylase. Enzyme xylanase

Năng su
ất
(Tạ/ ha)
2007 1096,1 4303,2 39,3
2008 1140,2 4573,1 40,1
2009 1089,2 4371,7 40,1
2010 1126,9 4606,8 40,9
2011 1082,7 4613,5 43,0
(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2011)
Số liệu bảng 2.2 cho thấy diện tích và năng suất và sản lượng ngô của
nước ta từ năm 2007 đến năm 2010 liên tục tăng. Diện tích ngô năm 2011
giảm so với năm 2010 là 44,2 nghìn ha (giảm 3,9%), giảm chủ yếu ở vụ đông
Miền Bắc, nhưng năng suất ngô vẫn đạt 43,0 tạ/ha. Sản lượng ngô năm 2011
vẫn tăng nhẹ so với năm trước. Cùng với sản lượng ngô liên tục tăng đó là
những phế thải mà quá trình sản xuất ngô tạo ra như thân ngô, lá ngô, lõi ngô.
Trong đó lõi ngô chiếm tỷ lệ khá lớn. Hiện nay các giống ngô thường có tỷ lệ
lõi/hạt chiếm từ 30 - 40%. Như vậy với sản lượng ngô khoảng 4,5 triệu tấn
mỗi năm thì lượng lõi ngô thải ra tương đương mỗi năm khoảng 1,35 - 1,8
triệu tấn, đây là một con số rất lớn. Thành phần các hợp chất trong lõi ngô
được thể hiện qua bảng 2.3 [4].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

Bảng 2.3. Thành phần các hợp chất của lõi ngô
STT Thành phần các hợp chất Hàm lượng chất khô %
1 Tro 1,13
2 Các chất hoà tan trong rượu 0,27
Các chất hoà tan trong nước ở 50
o
C

Hàm lượng xylan trong một số loại thực vật được thể hiện qua bảng 2.9 [4,7].
Bảng 2.4. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật
Thành phần hemicellulose (% khối lượng khô)
Loại thực vật
Galactan Xylan Arabino Mannan
Thân ngô, lõi ngô khô 1,0 - 1,2 19,0 - 23,0 1,8 - 3,4 0,3 - 0,7
Cỏ Switchgass khô 1,0 - 1,1 23,0 - 25,0 3,0 - 3,4 0,1 - 0,8
Cây gỗ ngắn ngày 0,7 - 1,2 13,0 – 17,0 0,4 - 1,1 0,9 - 1,3
Sợi khô 3,8 25,0 18,0 -
2.4. Giới thiệu chung về ñường xylose
2.4.1. ðặc ñiểm của ñường xylose
Xylose là một đường 5 cacbon, có công thức phân tử là C
5
H
10
O
5
.
Xylose còn có tên gọi là “đường gỗ”, là đường có mặt trong nhiều loại gỗ.
Khi thủy phân hemicellulose trong thân lúa mì người ta thu được 31% xylose,
59% glucose và khoảng vài phần trăm các đường khác (arabinose, galactose,
mannose…). Khi thuỷ phân rơm rạ thu được khoảng 18% pentose và 26,8%
hexose [1]. Công thức cấu tạo của đường xylose được thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.2. Công thức cấu tạo của ñường xylose
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

Xylose là thành phần chủ yếu thuộc đường pentose, cùng với glucose
là hai nhóm đường chính thu được khi thủy phân hemicellulose trong