1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM
Lớp 12DSH02
BÁO CÁO
THỰC HÀNH HÓA SINH

GVHD: Nguyễn Thị Hai
Sinh viên: Trương Thị Thảo MSSV:1211100186
Ngô Lê Hồng Duyên MSSV: 1211100062
Cao Thị Nhâm MSSV:1211100142
Đoàn Ngọc Kiểng MSSV:1211100293
Võ Nguyễn Anh Thư MSSV:1211100192
Phan Thị Thúy Vy MSSV: 1211100283
2

BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA
CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM HÓA SINH
Lý thuyết
I. Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh
a. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
 An toàn khi làm việc với axit
- Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng
với các axit tự do
- Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước .
 An toàn khi làm việc với kiềm
- Kiềm có thể làm cháy da
- Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm
- Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm

 Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lít
dung dịch.
Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
- Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất
đó tham gia.
 Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có
mặt trong dung dịch.
 Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
- Nồng độ mg/mL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch
4

- Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch
- Phần nghìn ,
0/
00
: số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch
- Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch
- Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch
 Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
a. Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w)
- Chất tan là chất rắn khan
- Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS0
4
.5H
2
O )
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.
b. Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn
c. Pha dung dịch bão hòa :
Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan . Nếu sau

dung dịch đó.
 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch.
a. Dung dịch chuẩn.
Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được
dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm.
 Cách pha dung dịch từ ống chuẩn:
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng
bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa
lắc và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3,
acid oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha,
pha loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, không thể pha ngay được dung dịch
chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi
pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.
b. Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
6

Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có
nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của
dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại
phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam
OH Do đó:
C
1
V
1
=C

2
HPO
4
– KH
2
PO
4
(Ph = 5,0 – 8,0)
- Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)
- Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)
- Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6)
- Dung dịch đệm vạn năng 0.1 M
7 CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1:
Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô.
Câu 2:
Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:
C
M
= (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol)
Thể tích H
2
SO
4
cần sử dụng là:
V
H2SO4

2
SO
4
4N
C
1
.V
1
= C
2
.V
2
 V2 = (1000 x 0.1)/4 = 25 (ml)
Câu 5:
- Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g)
- Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g)
- Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g)
Câu 6:
- Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)/100 =10 (g)
- Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 * 10)/37 = 27.03 (g)
 27.03 /1.19 = 22.71 (ml)
- Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml)

8

BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS)
LÝ THUYẾT
 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử

ống5
ống6
ống7
Glucose 1mg/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0
Nước cất(ml)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
Mẫu pha loãng(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
?
DNS (mol)
3
3

2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
OD540nm
C
Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml)
với mật độ quang OD540nm
10

 Tính kết quả:
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được mg/ml đường khử trong dung dịch
đường pha loãng.
Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc
Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn
Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ
quang OD
540
ở trên ta tính được hàm lượng đường khử P ở trong mẫu phân tích X.
       





 
Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X * n * V/m = 0.084 * 25 * 100/20 = 10.5

12

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG
PHÁP KJELDAHL
1. Định nghĩa:
- Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong các thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần protein như của các muối NH4+, các amino acid tự do, các peptide, urea và
các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purin và pyrimidine,… là nitơ phi protein
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
- Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ số
này phụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein. Thông thường nito chiếm 16% protein
nên hệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25
- Đạm tổng số = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi
- Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
MẪU
HỆ SỐ CHUYỂN ĐỔI
Nguồn gốc động vật
6.25
Hạt bông
5.30
Đậu phộng
5.46
Đậu nành
5.71
Hạt hướng dương
5.3
Cơm dừa

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa
nito dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
. Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini
acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO
2
và H
2
O, còn nito được giải phóng
dưới dạng NH
3
kết hợp với H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch.
2NH
3
+ H
2

4
+ H
2
O + 2NH
3

- NH
3
bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH
4
OH rơi vào bình hứng, bình hứng
chứa H
2
SO
4
0.1N
2NH
4
OH + H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ 2H
2

N(%) = {1.42/1000*(V
1
– V
2
)*100/m}*n
Trong đó:
- V
1
: số ml H
2
SO
4
cho vào trong bình
- V
2
: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
- m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại
- n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất
1.42: hệ số nito, cứ 1ml H
2
SO
4
dùng để trung hòa NH
4
OH thì tương đương với
1.42mg nito
Bài tập: pha loãng 50 lần sữa tươi nguyên chất Vinamilk bằng bình định mức
100ml, sau đó chưng cất đạm với lượng H
2
SO

4
+ H
2
O + 2NH
3

100ml 35ml
NH
3
 + H
2
O  NH
4
OH
2NH
4
OH + H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ 2H
2
O + H
2

– V
2
)*100/m}*n = {1.42/1000*(20 – 14.25}*100/100}*50
= 0.40825%
Nito (tổng số) = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi = 0.40825 x 6.25 = 2.5515625

Dd trước chuẩn độ Dd sau chuẩn độ
15

CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm
a) Vô cơ hóa mẫu.
- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa
nito dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
.NH
3
kết hợp với H
2
SO
4
dư tạo thành
(NH
4
)
2

O + 2NH
3

- NH
3
bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH
4
OH rơi vào bình hứng, bình hứng
chứa H
2
SO
4
0.1N
- 2NH
4
OH + H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ 2H
2
O + H
2
SO

)
2
SO
4
thành NH
3

Câu 4. Nếu thay H
2
SO
4
trong bình hứng bằng acid boric (H
3
BO
3
) thì kết quả có thay
đổi gì không?
Ta có: 0.1N H
2
SO
4
= 0.05M H
2
SO
4

Ta chuyển qua phương trình và 1.42 là hệ số nito, cứ 1ml H
2
SO
4

 mN=0.1*10
-3
* 14.2
16

3NH
4
OH + H
3
BO
3
 (NH
4
)
3
BO
3
+ 3H
2
O + H
3
BO
3 Dư
0.15*10
-3
*14.2 0.05*10
-3

 mN=0.15*10
-3

BRADFORD
Lý thuyết
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid,
khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi
kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở
bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung
dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine
serum albumin (BSA) . Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu
sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế
ta được OD
x
, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với nước
cất (OD
0
)
.
Lấy giá trị OD = OD
x
- OD
0
. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác
định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành.
Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo.
17

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250


C
- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)
2. Tiến hành
- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (5 g malt trích ly bằng nước thu
được V = 100 ml). Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích (mẫu
X).
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần
phân tích X - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm
0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để
yên, cứ tiếp tục cho đến hết.

19

Ống nghiệm
0
1
2
3
4
5
X
Nước cất (ml)
1
0.9
0.9
0.7
0.6

0.076
0.210
0.376
0.439
0.485
0.045

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước
sóng 595 nm. Ta có giá trị OD
0
, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD
1
), tương tự cứ
cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
3. Tính kết quả:
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD
595nm- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ
quang OD
595
ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.
y = 10,514x + 0,0015
R² = 0,9675
0
0,1
0,2
0,3
0,4


CÂU HỎI ÔN TẬP:
1. Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm.
- Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích
 Phải giảm bớt nồng độ protein trong mẫu, để khi đo nồng độ quang không bị vượt
quá giới hạn cho phép.
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu
cần phân tích X.
 Phải pha các nồng độ khác nhau để lập đường chuẩn. Để xác định protein trong
mẫu.
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 1, lắc đều để yên, cứ tiếp tục cho đến hết.
 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.
- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở
bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD
0
, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD
1
),
tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD
 Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein khi đó thuốc nhuộm hấp thu cực
đại ở bước sóng 595 nm.
21

2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.
 Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm.
 Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn.
 Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn.

LÝ THUYẾT:
I. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính của enzyme.
a. Định nghĩa
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗi
enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt động hay
hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản
phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc
tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản
phẩm phản ứng.
 Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:
Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời
gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay
sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử
dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký
và phương pháp hóa học.
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vị họat
tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp
.

b. Đơn vị hoạt tính của enzyme:
Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U)
Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định
nghĩa:
Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được
 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
23

 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10

lên hoạt tính enzyme. Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích
hợp như điều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm hoặc đk mà hoạt lực có thể đạt tối ưu.
- Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất
này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.
- Nồng độ cơ chất ở giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme, không quá cao
để kìm hãm enzyme, cơ chất được chuyển hóa 20%-30%.
24

- Thởi gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút.
- Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng( enzyme bị bất hoạt trước khi tiếp
xúc với cơ chất) song song với thí nghiệm.
IV. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt tính.
a. Khái quá về enzyme amylase.
b. Các phương pháp đo hoạt tính enzyme amylase.
- Nguyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dd enzyme
nghiên cứu thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành
giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu sẽ tính được
hoạt tính của enzyme.
- Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn
toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm.
THỰC HÀNH:
1. Dụng cụ - hóa chất:
a. Dụng cụ.
- Máy lắc.
- Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm.
- Bể điều khiển.
- Bình định mức.
- Ống nghiệm.
- Pipette 5ml, 1ml.
- Đồng hồ bấm giây.

sung nước cất đến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong b ình màu nâu để chỗ tối.
- Dung dịch tinh bột 1%: h òa tan 1 g tinh b ột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml
nước cất trong bình định mức 100 ml, lắc đều. Đặt v ào bếp cách thủy đang sôi, lắc li ên
tục cho đến khi tinh bột tan ho àn toàn. Sau đó làm ngu ội v
à b
ổ sung 10 ml đệm acetate
pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch
mức, lắc đều. Dung dịch đ ược chuẩn bị trong ngày sử dụng.
- Dung dịch enzyme gốc.
 Trích ly enzyme:
Enzyme được trích ly từ chế phẩm hay tế bào, mô động thực vật bằng dd đệm có pH
thích hợp như
- Trích ly enzyme từ vi khuẩn: Cân m= 0,1g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà
nhẹ chế phẩm trong cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H
2
O cất  lọc và
trích ly enzyme bảo quản 2-4 / 1 ngày.
- Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m=5g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà nhẹ
chế phẩm trong cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H
2
O cất +dd đệm