1
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT
ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161
LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC CHỮA BỆNH ðÁI THÁO ðƯỜNG

Hà Thị Tâm Tiến
1
, Lê Thanh Hoàng
2
1. Mở ñầu
Acarbose là một hợp chất hữu cơ giả ñường, tác dụng ức chế men α-glucosidase trong ruột
non. Do ñó, acarbose ñược sử dụng rộng rãi trong ñiều trị bệnh ñái tháo ñường type 2, tạo cho bệnh
nhân kiểm soát hàm lượng ñường trong máu tốt hơn sau khi ăn thức ăn chứa tinh bột [1]. Acarbose,
một sản phẩm tự nhiên do các chủng Actinoplanes sinh tổng hợp ra [4]. Acarbose thương mại ñã ñược
sản xuất từ sự lên men của các chủng Actinoplanes. Nhiều thí nghiệm về sự phân lập, lựa chọn các
chủng Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose cao, tạo ra các chủng Actinoplanes ñột biến, các công thức
môi trường, ñiều kiện lên men và quá trình tinh sạch acarbose ñã ñược thực hiện nhằm tăng năng suất
acarbose. Gần ñây, Wei và cộng sự ñã tối ưu môi trường lên men cho chủng Actinoplanes sp. A56
sinh tổng hợp acarbose, hàm lượng acarbose tăng từ 837 lên 1043 mg/l khi tăng nồng ñộ maltose 30
g/l lên 61,25 g/l và nồng ñộ dịch chiết ngô từ 10 g/l lên 17,5 g/l [9]. Lên men có sự bổ sung cơ chất
liên tục ñối với chủng Actinoplanes utahensis ZJB 08196 ñã ñạt năng suất 4878 mg/l acarbose, tăng
15,9 % so với phương pháp nuôi cấy thông thường [8]. Lên men với chủng Actinoplanes sp. A56 theo
phương pháp bổ sung cơ chất ñã ñạt năng suất 5000 mg/l acarbose [3]. Việc bổ sung thêm các chất
cảm ứng vào môi trường lên men ñể tăng năng suất acarbose cũng ñược nghiên cứu rộng rãi. Sun và
cộng sự lên men chủng Actinoplanes utahensis ZJB 08196 có bổ sung thêm S-Adenosylmethionine,
năng suất acarbose ñạt 6113 mg/l [6]. Xue và cộng sự lên men chủng Actinoplanes utahensis ZJB
08196 có bổ sung thêm validamine, năng suất acarbose ñạt 6606 mg/l [11].

PO
4
(Merck), HCl, ethanol, ethyl
acetate, methanol, acid fomic (Trung Quốc), bột ngô, monosodium glutamate (Việt Nam)
Hạt sắc ký: amberlite XAD 1600T, amberlite IRA67 (sigma), than hoạt tính (Việt Nam),
bản sắc ký lớp mỏng silica gel 60 F254 (Merck).
2.3. Môi trường
Môi trường thạch (g/l): 20 glucose, 5 peptone, 0,5 KCl, 1 K
2
HPO
4
, 0,5 MgSO
4
và 20 agar,
pH 7.
Môi trường nhân giống (g/l): 20 glucose, 5 peptone, 0,5 KCl, 1 K
2
HPO
4
và 0,5 MgSO
4
,
pH 7 [7].
Môi trường lên men (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate,
2,0 CaCl
2
, 2,5 CaCO
3
, 1,0 K
2

mạng polystyrene. 10 ml mẫu ñược ñưa lên cột và rửa cột bằng nước sau ñó thu mẫu bằng hỗn
hợp nước : acetone = 9:1 (v/v). Amberlite IRA67 là chất trao ñổi anion dạng base yếu dựa trên
mạng acrylic của chất giá ñể trung hòa các chất axít mạnh. Hạt amberlite IRA67 ñược ngâm hoạt
hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trước khi nhồi lên cột, sau ñó rửa cột bằng nước ñến khi pH trong
cột ñạt 7 [2]. 10 ml mẫu ñược ñưa lên cột và rửa giải bằng nước ñể trung hòa dung dịch có chứa
acarbose.
Xác ñịnh hoạt tính ức chế α-glucosidase theo phương pháp của Yamaki và Mori năm 2006
Sử dụng khay vi thể 96 giếng, thí nghiệm (TN) ñược lặp lại 3 lần, có ñối chứng (ðC).
Dịch nổi 20 µl ñược cho vào giếng TN, ñệm 0,5 M potasium phosphate buffer (PPB) 20 µl (pH
6,7) ñược cho vào giếng ðC, bổ sung vào mỗi giếng 50 µl emzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ
ruột chuột 25 mg/ml, 50 µl cơ chất 4-NPG (3mM), và 120 µl ñệm PPB, ủ hỗn hợp phản ứng ở
37°C. Sau khi ủ 45 phút, thêm 50 µl Na
2
CO
3
(0,67 M) vào mỗi giếng ñể kết thúc phản ứng [12].
Hỗn hợp phản ứng ñược ño ở bước sóng 415 nm trên máy Elisa reader (Biotek, ELx800, USA).
Mức ñộ ức chế α-glucosidase ñược tính theo công thức:
∆E
415
ðC – ∆E
415
TN
% ức chế =
∆E
415
ðC
x 100
Trong ñó, ∆E
415

C 1 2
Hình 1. Sắc ký ñồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
trong môi trường trước và sau tối ưu; 1: MT trước tối ưu; 2: MT sau tối ưu; C: chuẩn acarbose
Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong dịch lên men sau quá trình tối
ưu ñạt 54,2% tăng 5,4% so với trước khi tối ưu (Hình 2).
Hàm lượng acarbose trong dịch lên men sau tối ưu ñạt 9,98 g/l, trong khi ñó hàm lượng
acarbose trong dịch lên men trước tối ưu chỉ ñạt 2,91 g/l khi phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng
cao áp (HPLC) (Hình 3).
Như vậy, sau quá trình tối ưu các thành phần môi trường lên men và các ñiều kiện nuôi lên
men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñã thu ñược hàm lượng acarbose cao tăng gấp 3,4 lần so
với trước khi tối ưu. Hàm lượng acarbose ñạt ñược 9,98 g/l cao hơn hẳn so với các nghiên cứu
khác trên thế giới. Li và cộng sự (2012) lên men chủng Actinoplanes sp. A56 ñạt năng suất 5000
mg/l acarbose [3]. Wang và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 ñạt năng suất 4878
mg/l acarbose [8]. Sun và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 năng suất acarbose ñạt
6113 mg/l [6]. Xue và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 năng suất acarbose ñạt
6606 mg/l [11].

Hình 2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trường trước và sau tối ưu 4
(a)
Minutes
2 3 4 5 6 7 8 9 10
10
20
30
40
50

ESTD concentration
Area

Hình 3. Sắc ký ñồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 916
trong môi trường tối ưu; (a): Dịch lên men trước tối ưu; (b): Dịch lên men sau tối ưu
3.2. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase
3.2.1. Tinh sạch qua cột than hoạt tính 1
Dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñược hấp thụ vào than hoạt tính, sau ñó
giải hấp thụ bằng ethanol theo gradien nồng ñộ từ 0 ñến 20% ñể thu acarbose.
Kết quả TLC (Hình 4) cho thấy khi thu mẫu bằng ethanol 15% ñã thu ñược acarbose từ
phân ñoạn 14, nhưng ngoài băng acarbose còn thu ñược một băng khác cao hơn, ñến phân ñoạn
21 chỉ còn một băng acarbose duy nhất ngang chuẩn, sau ñó ñến phân phân 31 thì ñộ ñậm của
băng acarbose giảm dần và xuất hiện nhiều băng phụ thấp hơn.
Như vậy sau khi cho dịch lên men qua cột than hoạt tính 1 chúng tôi ñã thu ñược acarbose
tinh sạch một phần tiếp tục ñược tinh sạch qua cột than hoạt tính 2
3.2.2. Tinh sạch qua cột than hoạt tính 2
Kết quả dịch tinh sạch gồm 3 nhóm chính: 20 ml ñầu tiên không có chất nào ñược ñẩy ra,
30 ml tiếp theo tạp chất ñược ñẩy ra, có một băng cao hơn chuẩn, 10 ml sau ñó acarbose ñã ñược
ñẩy ra cùng với tạp chất (2 băng), 40 ml cuối cùng ñã thu ñược hoạt chất acarbose có một băng
ngang với chuẩn (Hình 5). C 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10 11 LC 12 13 14 15 16
C 17 18 19 20
LC 21 22 23 24 C 25 26 27 28 29 30 31 32 3
3 34 C 35

6
(b)
(c)

Hình 6. Sắc ký ñồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 ; (a) : chuẩn acarbose ; (b) : dịch lên men ; (c) : dịch tinh sạch
3.2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase
Kết quả hình 7 cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose tinh sạch
ñạt 68,7%, tăng 1,6 lần so với dịch lên men (42,9%) và tăng 4,2 lần so với dịch qua cột than 1
(16,5%). Dịch qua cột than 2 có hoạt tính ñạt 58,0% cao hơn dịch lên men và dịch qua cột than 1
và thấp hơn dịch tinh sạch khi qua hai cột amberlite XAD 1600T và IRA67.

Hình 7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC
9161 sau khi qua các cột tinh sạch; DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh sạch.
4. Kết luận
Môi trường thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC
9161 gồm (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl
2
, 2,5
CaCO
3
, 1,0 K
2
HPO
4
trong ñiều kiện pH 6,5, nhiệt ñộ 25
o
C, tốc ñộ lắc 150 vòng/phút và thời gian

9 1849-1854.
10. Whistler RL, Durso DF (1949) "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal". Purdue
University 72 667-679.
11. Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013) "Enhanced production of acarbose
and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of
Actinoplanes utahensis ZJB-08196". BioMed Research International 9 pages.
12. Yamaki K, Mori Y (2006) "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods :
a trial using slope factors of regression curves". Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 53 (4):
229-231.