MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bacteriocin là một loại protein được tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có khả
năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.
Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925. Ông thực hiện công
trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này tác
động mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn được
sinh ra từ vi khuẩn [45].
Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái. Bacteriocin có
khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi
tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải
ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì
vậy bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, xử lý môi
trường, chế biến thức ăn chăn nuôi [16].
Vi khuẩn lactic hiện nay được quan tâm nhiều do chúng có khả năng
sinh tổng hợp nên bacteriocin. Vì thế việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic và
bacteriocin là một vấn đề hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộc
sống con người[40].
Vi khuẩn lactic được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là
trong công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có
khả năng sinh axit, tạo hương và kháng một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin[3].
Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn cũng như
tạo ra những chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp bacteriocin cao để
sử dụng trong quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản
mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại sản phẩm có tính chất và hương vị


mong muốn[41]. Các hướng ứng dụng của bacteriocin chủ yếu gồm:
- Bảo quản thực phẩm
- Bảo quản các sản phẩm sữa

2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin cao.
-Khảo sát một số đặc điểm sinh lý và các yếu tố ảnh hưởng đến khả
năng tổng hợp bacteriocin của chủng tuyển chọn.
- Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và tìm hiểu về bản chất
của bacteriocin thu nhận.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
- Xác định tính chất đối kháng của bacteriocin với một số loại vi sinh
vật gây bệnh.
-Xác định được điều kiện nuôi cấy tốt nhất để vi khuẩn lactic sinh tổng
hợp bacteriocin cao.
- Bước đầu tìm hiểu về bản chất của bacteriocin
4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Đẩy mạnh hướng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc sản
xuất các chất bảo quản dùng cho thực phẩm.
5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Luận văn bao gồm các chương mục sau:
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng và hình vẽ
Mở đầu


Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo



35oC. Khi phát triển trong sữa chúng có thể làm tích lũy khoản 0.8-1.0% axit
lactic tức là khoảng 110-120ot (1ot là lượng axit chứa trong 100ml sữa được
trung hòa bởi 1ml NaOH 0.1N).
Streptococcus cremoris là loại cầu khuẩn xếp thành hình chuỗi, phát
triển tốt nhất ở 25-30oC, không có khả năng lên men maltose và dextrin, khả
năng tích lũy axit lactic tương tự như Streptococcus lactic, gram dương và
không sinh bào tử.
Lactobacillus bulgariccus là loại trực khuẩn hình que dài, phát triển tốt
ở 40-48oC, có khả năng tích lũy đến 3-3.5% axit lactic, gram dương và không
sinh bào tử.
Lactobacillus acidophillus có hình dạng tương tự như Lactobacillus
bulgariccus. Chúng cũng phát triển tốt ở 40oC, không sinh bào tử.
Vi khuẩn Lactobacillus delbruckii là loại trực khuẩn hình que ưa nhiệt,
chúng thích hợp phát triển ở 48-52oC và có khả năng tích lũy axit lactic, gram
dương và không sinh bào tử.
S .citrovorus, S. paracitrovorus, S. diaxeli lactic và S. thermophilus có
tế bào thường xếp thành hình chuỗi, gram dương và không sinh bào tử.
L. lactic, L. thermophilus là những trực khuẩn không tạo bào tử, gram
dương không di động.
L. casei và L. plantarium là những trực khuẩn xếp thành từng chuỗi,
gram dương và không sinh bào tử.
1.1.2.Quá trình lên men lactic [5]
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic và các
sản phẩm khác được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào các sản
phẩm tạo thành mà các quá trình lên men lactic được chia làm hai loại: lên
men đồng hình và lên men dị hình. Trong quá trình lên men đồng hình, sản
phẩm chính là axit lactic. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ axit bay hơi, rượu


axit sucxinic

axit acetic

Số lượng các sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,
vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, thông thường axit lactic
chiếm 40%, axit sucxinic chiếm khoảng 20%, rượu etylic chiếm khoảng
10%, axit acetic chiếm khoảng 10% và các loại khí chiếm khoảng 20%.
Trong số các loại vi khuẩn lên men lactic điển hình cần phải kể đến
các loài: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Lactobacillus
bulgariccus,

Lactobacillus

(thermobacterium

cereale),

acidophillus,

Lactobacillus

Lactobacillus

plantarum,

delbruckii
Lactobacillus

cucumeris fermentatic. Còn thuộc loại vi khuẩn lên men lactic không điển

triển tốt ở 45-62oC. Loại ưa ấm gồm có L. causasicus, L. lactis, L. helveticus,
L. acidophilus, L. bifidus phát triển tốt ở 37-45oC. L. casei, L. plantarum,
L.leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus.. phát triển tốt ở 28-32oC.

1.1.3.4. Muối khoáng


Photphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu.
Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song chúng
gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hoá một số axit amin. Sự có mặt
của một số loại muối khoáng không phải là bắt buộc và hàm lượng có sẵn của
chúng trong các môi trường phức hợp đã là đầy đủ.
1.2.TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN
1.2.1.Giới thiệu chung về Bacteriocin [34], [45]
Bacteriocin là một loại protein được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có
khả năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.
Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình
nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc
đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn
sinh ra từ vi khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả
năng tiêu diệt E.coli.
Những năm gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập
trung vào vi khuẩn gram âm, trong đó điển hình là colicins. Tuy nhiên những
nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng
đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo đã cung cấp những thông tin về vấn
đề này.
Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi
khuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin... Người ta đã
đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùng
trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa

cứu về mặt di truyền.
Phương pháp đối kháng dần dần do Fredericq đưa ra sau đó được cải tiến
thêm. Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm được nuôi ủ trên đĩa thạch


trong một khoảng thời gian. Tiếp đó chủng chỉ thị được trải lên bề mặt của đĩa
thạch có chủng thử nghiệm. Phương pháp này có độ nhạy hơn so với phương
pháp đối kháng đồng thời và phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian
và điều kiện nuôi ủ của chủng chỉ thị và chủng thử nghiệm. Một điểm hạn chế
của phương pháp này là yếu tố gây ức chế có thể bị bất hoạt do chất gây mê.
Cần kiểm tra cả hai phương pháp này để nhận biết một chủng có hoạt
tính kháng khuẩn hay không. Điều kiện tối thích cho chủng thử nghiệm phát
triển không cần thiết bằng điều kiện để chủng đó sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn nhiều nhất.
Việc áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vi
khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Hạn chế của những phương
pháp này là không xác định cụ thể hoạt tính của bacteriocin. Cần loại bỏ
những yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin.
1.2.2.2.Quan hệ giữa tính đối kháng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
Khi nghiên cứu bacteriocin cần loại bỏ những hiện tượng giống
bacteriocin. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh ra kháng chất giống
bacteriocin. Một yếu tố quan trọng để phân biệt giữa bacteriophages và
bacteriocin là bacteriocin không mang yếu tố di truyền để tự nhân bản.
Hamon và Peron đã dùng những phương pháp khác nhau để phân biệt
bacteriophages và bacteriocin. Trong đó bacteriophages kháng trysin hơn
bacteriocin còn bacteriocin không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím và nhiều loại
bacteriocin chịu nhiệt rất tốt.
Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzim bacteriolytic có
trọng lượng phân tử thấp có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó để
phân biệt. Tóm lại có nhiều yếu tố có tính đối kháng không có bản chất

các pha khác nhau của một chu kỳ phát triển. Việc sinh tổng hợp bacteriocin
tốt nhất ở pha phát triển và giảm dần ở những pha tiếp theo. Nhiều nghiên cứu
cho thấy bacteriocin được sinh ra sau 8 giờ, đạt tối đa sau 18 giờ đến 24 giờ
và sau đó không sinh bacteriocin nữa [23].


Việc kiểm soát pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin.Tuỳ từng loại vi sinh vật mà việc điều chỉnh pH là
khác nhau.
1.2.4. Phương pháp chiết tách bacteriocin [2]
Bacteriocin có bản chất là protein nên việc chiết tách bacteriocin chính
là chiết tách protein. Các phương pháp chiết tách và tính sạch protein đều dựa
trên những tính chất hoá lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử,
độ hoà tan của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân
tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất
của các liên kết. Muốn thu nhận protein nguyên thể tức là protein có tất cả
tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau
1.2.4.1. Phương pháp nhiệt độ:
Để tách các protein khác nhau dựa trên khả năng kết tủa của chúng
người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của
nhiệt. Phương pháp này chỉ nên dùng với các protein bền với nhiệt. Dịch
protein được giữ ở 50-70oC trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị
biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein
thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận
nghịch.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch
bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu
cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0oC để tránh biến tính.
1.2.4.2.Phương pháp nồng độ proton
Protein là các chất lưỡng tính vì vậy trong dung dịch axit và kiềm

điện của protein. Điểm đẳng điện của các axit amin trung tính có giá trị pH tử
5.6-7.0, đối với các axit amin có tính axit là từ 3.0-3.2, đối với các axit amin
có tính kiềm là từ 9.7-10.8. Ở điểm đẳng điện độ hoà tan của protein là thấp
nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này người ta có thể tách từng
phần protein trong hỗn hợp. Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt
độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc


nhờ tác dụng của pH môi trường. Dịch protein được giữ ở pH
vi khuẩn gram dương
Bacteriocin
Megacin A-216

Nhiệt độ cho pH

Ảnh hưởng của enzim

phép

Nhạy

60oC/30phút

2-7

Bền

Chymotrypsin
Pepsin

Clostosin A

o

100 C/30 phút

4-9

Trypsin

Rnase

Chymotrypsin DNase
Clostosin D

o

100 C/30 phút

4-9

Pronase P
Trypsin

Rnase

Chymotrypsin DNase
Boticin E-S5

Boticin P

o

100 C/10 phút

o

60 C/30 phút

1.1-

2-12
2-12

Trypsin
Trypsin


1.2.6.Phổ hoạt động của bacteriocin[34]
Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có
hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng. Đối với bacteriocin được sinh tổng
hợp bởi vi khuẩn gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn gram
dương. Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn gram âm bị ức chế bởi bacteriocin
hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn gram dương. Những vi
khuẩn gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn gram âm như Lactobacillus
acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria.
1.2.7.Phương thức hoạt động của bacteriocin[34]
Cơ chế kháng khuẩn được thực hiện trên các plasmids. Có 2 lớp
plasmid, lớp lớn là những plasmid có số lượng sao chép thấp và lớp nhỏ là
những plasmid có số lượng sao chép cao. Những plasmid lớn mang những
gen khác như colicin operon. Colicin operon thường được cấu tạo bởi một số
gen chính. Những gen này bao gồm một gen miễn dịch, môt gen cấu trúc
colicin và một Brp (bacteriocin release protein). Nghiên cứu cho thấy việc
duy trì plasmid colicin rất quan trọng đối với tế bào có họ hàng với chúng bởi
vì nếu một tế bào mất gen miễn dịch nó nhanh chóng bị phá hủy bởi colicin.
Cùng lúc colicin được phóng ra từ tế bào phân chia bằng việc sử dụng lysis
protein làm chết tế bào.
Bản thân colicin bao gồm 3 phần hình cầu. phần thứ nhất quy định mục
tiêu và gắn với cơ quan cảm nhận của tế bào nhạy cảm. Phần thứ 2 liên quan
đến chuyển mã hợp tác với tế bào mục tiêu. Phần thứ 3 là có chức năng tiêu
diệt và tạo ra một lổ trong màng tế bào mục tiêu hoặc hoạt động như một hạt

động vật. Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tính
với indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và


citrate. Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh,
dùng kháng thể tương hợp với kháng nguyên O, H và K của các chủng E.coli
khác nhau.
Phần lớn E.coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh. Nhóm
E.coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E.coli diarrheagenic
E.coli) thuộc nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác
nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúng
thuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc
nhóm xâm nhiễm dạng Shigella. Một nhóm E.coli gây bệnh khác là EIEC
(enteroinvasive E.coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do
xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người. Nhóm E.coli gây bệnh cuối cùng là
ETEC (enterotoxigenic E.coli) có khả năng sinh một hoặc cả hai loại độc tố
ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không có tính
kháng nguyên.
Một trong những đặc tính quan trọng của E.coli liên quan đến khả năng
chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là do thời hạn sống sót của chúng. Chúng
thường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnh
khác có ở ruột. Ở thực phẩm qua các biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông,
chiếu xạ E.coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác vẫn
chống chịu được và sống sót. Tương tự như vậy nước qua xử lý vẫn chứa một
số vi sinh vật gây bệnh trong khi E.coli đã bị tiêu diệt. Chỉ đối với những thực
phẩm có tính axit E.coli mới thực sự có giá trị như một chỉ thị về vệ sinh do
tính chống chịu cao của chúng đối với pH thấp [1].


1.3.2. Salmonella

trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể
phát triển trên môi trường nuôi cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi
trường thạch rắn khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt,
hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua ánh sáng phản chiếu dưới góc 45oC.
Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2.5 oC
và cao đến 44oC. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý đến việc làm vệ
sinh ống dẫn lạnh trên trần vì đó là nới có điều kiện thuận lợi cho Listeria
phát triển và tích tụ. Bởi sản phẩm sữa từng dính dáng đến các cơn dịch bệnh
so Listeria, nhiều nghiên cứu được tập trung vào loại sản phẩm này. Câu hởi
liệu Listeria monocytogenes có sống sót qua được chế độ thanh trùng kiểu
Pasteur (63oC trong 30 phút hoặc 72 oC trong 15 giây) hay không hiện vẫn
còn bỏ ngỏ bởi chưa ai có được câu trả lời khẳng định. Điều đáng lưu ý là chế
độ thanh trùng sữa hiện nay vẫn chưa tính đến khả năng chịu nhiệt của
Listeria monocytogenes.
Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa được
biết. Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt
nhẹ. Trường hợp nặng chủng gây bệnh có thể sản sinh trong các đại thực bào
và gây nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim,
mắt và có thể thâm nhập bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai, đẻ non hoặc
nhiễm trùng thai nhi.
Listeria monocytogenes được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác
nhau như thịt, cá, rau, sữa và cả nước bề mặt. Cần chú ý kiểm tra sự hiện diện
của vi sinh vật ở mọi công đoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi


trường, nguyên liệu, điều kiện sản xuất, vận chuyển đến sản phẩm cuối cùng.
Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu để giảm nguy cơ nhiễm bệnh
[1].
1.3.4. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là cầu khuẩn hiếu khí tùy nghi Gram dương

NaCl tối đa ở đó Staphylococcus aureus có thể phát triển còn phụ thuộc vào
những thông số khác như nhiệt độ, pH, hoạt tính nước [1].
1.4.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG BACTERIOCIN TRONG
VÀ NGOÀI NƯỚC
1.4.1. Trên thế giới:
Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh
tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan
tâm. Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công ,
góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Bacteriocin
là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ
khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú
hơn.
Năm 1970, nhóm tác giả D.A. Kekessy và J.D.Piguet thuộc viện Vệ
sinh và An toàn thực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới
trong việc phát hiện bacteriocin. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên
đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5mm
bằng cách khoét bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ
xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng [23].
Năm 1976, nhóm tác giả John R. Tagg, Adnan S. Dajani và Lewis W.
Wannamaker thuộc khoa vi sinh- trường đại học Otago, New Zealand, trường
đại học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin
của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu đã
cho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại
bacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tính
bacteriocin, các loại hoạt động của bacteriocin và ứng dụng của bacteriocin
[25].


Năm 1992, nhóm tác giả R.Yang, M.C Joshnon và B. Ray thuộc Đại