TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ
BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM
ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC
XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU HOẠCH TẠI PHƯỜNG
KHÁNH XUÂN, THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trinh
Lớp: Cử nhân sinh K11
Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hóa
Đắk Lắk, ngày 09 tháng 10 năm 2014
MỤC LỤC
Contents
2
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề.
Việt Nam là một nước đang phát triển với nền tảng là một nước nông nghiệp. Từ
một nước có hàng ngàn người chết vì nạn đói năm 1968. Đến nay, Việt Nam là một trong
những nước có số lượng nông sản xuất khẩu đứng đầu thế giới.
Đắk Lắk nói chung và phường khánh xuân nói riêng, là trung tâm sản xuất nông
nghiệp của vùng tây nguyên. Từ nhiều năm nay, khu vực sản xuất rau an toàn ở tổ dân
phố 12 thuộc hợp tác xã Nông nghiệp Thuận Hòa (Phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma
Thuột) đã trở thành nơi tin cậy của nhiều người tiêu dung, các nhà nghiên cứu khoa học
và các nhà quản lý sản xuất nông nghiệp.
Tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Nông nghiệp Thuận Hòa được thành lập tháng
6 năm 2008 với số hội viên ban đầu là 28 hộ nông dân có tổng diện tích đất sản xuất là
5,6 ha, đến nay, số hội viên của HTX đã tăng lên 44 hộ với tổng diện tích là 6,6 ha
[1][6]
. Số
diện tích đất sản xuất rau tăng lên cũng đồng nghĩa với lượng phế phụ phẩm trong sản
xuất nông nghiệp cũng tăng lên. Lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch
được người nông dân sử dụng dung dung để đun nấu và một phần rất nhỏ được dung để

Hòa, tổ dân phố 12, phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột.
4
PHẦN I . TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về phường Khánh Xuân
1.1.1 Điều kiện tự nhiên
 Vị trí địa lý:
Diện tích: tổng diện tích tự nhiên là 21,88 km
2
. Phường Khánh Xuân được thành
lập ngày 21, tháng 1, năm 1995
Tọa độ:
• 12
o
38’34”B
• 107
o
59’17”Đ
- Phía Đông tiếp giáp phường Ea Tam, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Tây tiếp giáp xã Hòa Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Nam giáp xã Hòa Khánh, thành phố Buôn Ma Thuột.
- Phía Bắc giáp Phường Tân Thành, thành phố Buôn Ma Thuột.
 Địa hình, địa chất
Phường Khánh Xuân có địa hình tương đối gồ ghề và có hướng nghiêng dần từ
Đông sang Tây.
Đất nâu vàng trên đá Bazan thích hợp với nhiều loại cây công nghiệp hàng năm
và lâu năm.
Đất đỏ vàng trên đá phiến sét.
Đất đen trên sản phẩm đá Bazan.
 Khí hậu, thủy văn:
Phường Khánh Xuân nằm ở vùng khí hậu cận nhiệt đới, khí hậu gió mùa, một năm

• Rừng tự nhiên: 0 ha
• Rừng trồng: 38,8 ha
 Nông nghiệp:
Tổng diện tích đất gieo trồng cả năm là 1.673 ha.
Trong đó trồng các loại cây sau:
Bảng 1: Các loại cây trồng và sản lượng hàng năm tại phường Khánh Xuân
TT
TÊN CÁC LOẠI
CÂY TRỒNG
SỐ LƯỢNG/
SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM
1 Cà phê 990 tấn
2 Tiêu 84 tấn
3 Điều 112,8 tấn
6
4 Lúa 2.628 tấn
5 Rau các loại 3.300 tấn
6 Hoa màu 45 ha/270 tấn
Chăn nuôi:
Bảng 2: Các loại vật nuôi và sản lượng hằng năm tại phường Khánh Xuân
TT
TÊN CÁC LOẠI VẬT
NUÔI
SỐ LƯỢNG/
SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM
1 Heo 700.000 kg
2 Gà 180.000 kg
3 Bò 375.000 kg
4 Ong 1.075 thùng
5 Cá 90.000 kg

phê, thân cây bắp… được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ tại một khu
vực nhỏ.
8
Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng lớn phế phẩm không được sử dụng, đặc biệt là
phế phụ phẩm rau xanh. Chúng thường được người dân đem đổ bỏ sau khi thu hoạch, khi
phân hủy thì chúng tạo ra mùi hôi thối rất khó chịu và gây ô nhiễm môi trường.
1.3. Vi sinh vật dùng trong xử lý.
1.3.1. Các nhóm vi sinh vật
 Các vi khuẩn hiếu khí: Chủ yếu là các vi sinh vật thuộc các chi Arzotobacter,
Achromobacter, Pseudomonas, Cellumonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga,
Angiococcus, Polyangium….
 Các vi khuẩn kị khí: Điển hình là các vi khuẩn có trong dạ dày của động vật nhai lại như
các vi khuẩn thuộc các chi Ruminococcus flavefeciens, R. albus, R. parvum, Bacteroides
succinpgenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium
cellulosolvens….
 Các xạ khuẩn hiếu khí: Là các vi khuẩn thuộc các chi Micromonospora, Proactinomyces,
Actinomyces, Streptomyces…
 Các nhóm vi nấm: Nẩm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một
lượng lớn enzymes có đầy đủ các thành phần. Ví dụ như Nấm mốc ( thuộc các chi:
Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium…), Nấm đốm (ví dụ như các loài:
Ceratocystis sp, Cladosporium sp, Aureobasidium sp, …), Nấm mục (là các loại nấm
thuộc các chi: Chaetomium, Humocola và Phialophora).
[2]
1.3.2. Vi sinh vật phân giải cenlulose
Cenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật. Cenlulose là hợp chất rất
bền vững, đó là loại polysaccharide cao phân tử. Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật
sinh ra các men xúc tác cho quá trình phân giải cenlulose. Chúng có ý nghĩa rất lớn trong
việc thực hiện vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc
nâng cao độ phì nhiêu của đất.
Cenlulose có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện thoáng

1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis.
1.4.1. Lịch sử phát hiện.
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 bởi Christion Erenberg
và ông đã dặt tên cho loài vi khuẩn này là “Vibrio subtilis”.
Hơn 30 năm sau, Casimir Davaine đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là
“Bacteridium”.
Đến năm 1872, Ferdimand Cohn đã quan sát loài vi khuẩn này có đầu hình vuông
và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện được vi khuẩn Bacillus
subtilis trong phân ngựa. Lúc đầu chủ yếu được dùng trong phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ
của Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949-1957, khi
Henry và các cộng sự tách được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết. Từ đó,
“thuốc subtilis” hay còn gọi là “subtilis therapy” ra đời và được sản xuất hàng loạt dùng
trong diều trị các chứng viêm đại tràng, viêm ruột, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa.
Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, nó được sử dụng rộngrãi trong y
học, thực phẩm, chăn nuôi.
[4]
1.4.2. Đặc điểm phân loại, sự phân bố và đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn Bacillus
subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
10
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng phân bố
hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng nhiều cư trú trong đất, đặc biệt là cỏ khô nên còn
được gọi là trực khuẩn cỏ khô, thông thường các loại đất trồng trọt có chứa khoảng 10 –

C.
11
- Nhu cầu oxy: Bacillus subtilis phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy và phát
triển tốt trong môi trường giàu oxy vì vi khuẩn thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc.
- Độ pH: Bacillus subtilis phát triển mạnh ở pH = 7,0 – 7.4.
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường thạch đĩaTSA: khuẩn lạc tròn, rìa rang cưa không đều, có tâm sẫm
màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi
nâu.
+ Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám. rìa nhăn gợn sóng.
+ Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
+ Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
+ Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn, lắng cặn kết lại như vầng mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
[4]
1.4.5. Đặc điểm sinh hóa
Khi lên men, vi khuẩn Bacillus subtilis không tạo ra các loại đường: glucose,
maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose.
Thử nghiệm Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase
(+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
[4]
Bảng 4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -
MR +

sinh sản của vi khuẩn
Quá trình hình thành bào tử bao gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng vi khuẩn Bacillus
subtilis cần khoảng 8 giờ để hoàn tất quá trình hình thành bào tử. Ban đầu khối nguyên
sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định
trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào
tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi
tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của
chúng sẽ bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh
dưỡng chỉ có thể tạo ra một bào tử duy nhất nên đây không phải là một hình thức sinh sản
của vi khuẩn mà nó chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện
sống bất lợi
[4]
.
1.4.7. Hệ enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis
13
Trong tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis, cũng như trong các vi sinh khác đều có
những enzymes xúc tác cho các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp
và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có kkhar năng di chuyển
qua màng tế bào, chúng dược gọi là các enzyme nội bào.
Các enzyme nội bào của vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm: các enzyme thủy phân
như protease nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; Các enzyme tổng
hợp như aspagagin-syntetase; Các enzyme tham gia vào các quá trình oxy hóa – khử như
Dehydrogenase, Oxydase, Cytochrom, Peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa
vật chatas có trong tế bào.
Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết
cho quá trình sống để thích nghi với điều kiện môi trường gọi là các enzyme ngoại bào.
Chúng bao gồm các enzyme như: amylase (α-amylase), β-glucanase, xylanase,
protease…
[5]

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
14
Việc xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp đã và đang được rất quan tâm, đã có rất
nhiều nghiên cứu để xử lý và tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp.
Năm 2010 Nguyễn Duy Khang đã chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sản xuất giá thể
trồng hoa lan từ các phế phụ phẩm nông nghiệp ở Lâm Đồng. Các nhà sinh học tại viện
nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã hoàn thiện được quy trình này.
[6]
Nhóm nghiên cứu đã sử
dụng các loại phế phẩm như bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận
dụng trong sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, có khả năng phân
giải các phế phụ phẩm này thành các giá thể trồng hoa, không chỉ hoa địa lan mà còn có
thể trồng nhiều loại hoa cũng như các loại cây cảnh khác thay cho các giá thể truyền
thống. Hiện đề tài đang được tiếp tục phát triển theo hướng dự án thử nghiệm và sản xuất
trên diện rộng để đáp ứng nhu cầu của bà con nông dân.
Tại Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 diễn ra tại Đại học Đà
Nẵng năm 2010 2 sinh viên trường Đại học Bách Khoa đã báo cáo đề tài nghiên cứu sử
dụng các phế phẩm nông nghiệp để chế tạo tấm Panel cách nhiệt sử dụng trong dân dụng
và công nghiệp
[7]
. Các tấm panel mặc dù được sản xuất thủ công nhưng chất lượng thẩm
mỹ có thể sử dụng đượctrong công nghiệp và đời sống và có thể sử dụng vào nhiều mục
đích khác nhau như la phông, trang trí trần… đây là đề tài mới và ý nghĩa thực tiễn cao.
Năm 2013 Trần Thị Tâm, Lương Hữu Thành, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản,
Phạm Bích Hiên đã nghiên cứu sử dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học xử lý phế phụ
phẩm nông nghiệp
[8]
. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis,
Streptomyces hygroscopicus, Bacillus polyfermenticus và Bacillus velezensis được lựa
chọn từ microbial di truyền nguồn lực của viện thổ nhưỡng Nông hóa cá thể phá vỡ các

khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa. Sau khi thu gom, ta sẽ trộn đều những
thứ thu được rồi chia thành từng đống nhỏ để tiến hành nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học xử lý nước thải
Lấy 1g mẫu chế phẩm sinh học pha loãng bằng nước muối sinh lý; Cấy trải trên
môi trường dinh dưỡng MPB, ủ ở 37
o
C. Sau 24 giờ, thu từng khuẩn lạc đơn, cấy ria khuẩn
lạc trên môi trường thạch nghiêng. Làm thuần khiết khuẩn lạc sau nhiều lần cấy ria trên
16
đĩa thạch. Đánh dấu kí tự các chủng vi khuẩn. Quan sát, mô tả hình thí khuẩn lạc các dòng
vi khuẩn phân lập.
2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng sử dụng oxy của vi khuẩn phân lập
Nguyên tắc: dựa trên nhu cầu khác nhau của vi khuẩn đối với oxy. Căn cứ vào
quan hệ đối với oxy, vi khuẩn được chia thành 4 nhóm lớn như sau:
1. Hiếu khí bắt buộc: vi khuẩn sinh trưởng trên bề mặt và lớp trên cùng của
ống môi trường.
2. Vi hiếu khí: vi khuẩn sinh trưởng cách bề mặt môi trường.
3. Kỵ khí không bắt buộc: vi khuẩn phát triển dọc theo cả chiều dài của ống
môi trường.
4. Kỵ khí bắt buộc: vi khuẩn chỉ phát triển dưới đáy ống môi trường.
Dựa vào vị trí phân bố trong ống môi trường như trên để xác định nhu cầu oxy của
vi khuẩn phân lập
[11]
.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị ống giống vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB lỏng (cao thịt 3g,
pepton 10g, NaCl 5g, nước cất 1000ml; khử trùng ở áp suất 1atm trong 30 phút).
- Tạo các ống chứa khoảng hơn ½ môi trường MPB đặc để xác định nhu cầu oxy của các vi
khuẩn Bacillus subtilis. Sau khi khử trùng, không tạo thạch nghiêng, để ống nghiệm thẳng
đứng.

2.3.4.2. Phương pháp định danh sinh học phân tử
Mẫu được gửi đến Công ty Nam Khoa, Tại địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn,
phường Tân Hưng, quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.
2.3.5. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn
Lấy 0,1ml chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi trong 10ml môi trường MPB lỏng và
đánh giá sự sinh trưởng của vi khuẩn qua phương pháp đo độ đục
[9]
(OD 610nm) của
dung dịch nuôi cấy vào các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 giờ. Dựa trên nồng độ
OD và thời gian nuôi cấy của chủng lập đồ thị đường cong sinh trưởng cho chủng được
tuyển chọn. Mỗi thời điểm khảo sát lặp lại 3 lần.
2.3.6. Phương pháp xây dựng đường cong tuyến tính giữa nồng độ vi khuẩn và chỉ
số OD 610nm
Nhân nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB. Xác định độ đục của
dung dịch vi khuẩn ở các độ pha loãng khác nhau. Tại mỗi độ pha loãng của dung dịch
có OD trên được cấy trãi trên môi trường thạch đĩa. Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa môi
18
trường ở các độ pha loãng. Mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 đĩa peptri. Kết quả được
tính như sau:
Trong đó:
- A : Số tế bào vi khuẩn trong một mẫu ban đầu
- N : Tổng số khuẩn lạc đếm được
- n : Số đĩa có khuẩn lạc đếm được tại mỗi nồng độ pha loãng
( đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250).
- v : Dung tích mẫu cấy vào mỗi đĩa
- fi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm.
Dựa vào phương trình tương quan trên để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn của
dung dịch thông qua chỉ số OD 610nm.
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển
của vi khuẩn tuyển chọn

2.3.7.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc
Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis được lựa chọn cho vào trong 50ml
môi trường dinh dưỡng phù hợp với các tốc độ lắc khác nhau: 100, 150, 200 vòng/phút.
Sau 3 ngày nuôi cấy, thông qua đo độ đục (đo OD 610nm) đánh giá khả năng thích ứng
của vi khuẩn. OD càng cao thì tốc độ lắc đó thuận lợi nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
được lựa chọn.Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của vi khuẩn đến gốc rau
2.3.8.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng xử lý
Lấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tuyển chọn, sau khi nhân giống, đem
pha loãng với môi trường nhân giống MPB ở các nồng độ khác nhau, ở từng độ pha loãng
đem đo OD, dựa trên phương trình tương quan về mật độ tế bào với OD từ đó suy ra mật
độ tế bào ở từng độ pha loãng khác nhau.
Tiến hành lấy 20ml giống pha loãng ở mỗi nồng độ khác nhau, bỏ vào 4 đống gốc
rau, mỗi đống có cân nặng khoảng 15kg đã được trộn đều.
Lô đối chứng gồm 2 lô, một lô không cho vi khuẩn vào và một lô cho chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis đã được phân lập trong đề tài của sinh viên Nguyễn Thị Duyên
Anh, lớp Cử nhân Sinh học K10.
Sau 5 ngày xử lý, thu mẫu, xác định khối lượng của gốc rau còn lại sau khi xử lý.
Thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần.
2.3.8.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng xử lý
của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được theo dõi ở các lô thí nghiệm sau:
Lô 1: Thời gian xử lý 5 ngày.
Lô 2: Thời gian xử lý 10 ngày.
Lô 3: Thời gian xử lý 15 ngày.
Lô 4: Đối chứng (không sử dụng vi khuẩn).
20
Lấy 20ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn, cho vào 5 đống
gốc rau, mỗi đống khoảng 15kg. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Dung dịch vi khuẩn cho
vào mỗi đống và mỗi lô phải đồng nhất.