BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN VÀO
CÂY HOA CẨM CHƯỚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP SÓNG SIÊU ÂM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành : 111 GVHD: TS. NGUYỄN THỊ THANH
SVTH : TRƯƠNG KHÁNH LINH
MSSV : 105111081
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng 21
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng 26
1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh 27
1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Cẩm chướng 33
2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp 34
2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 35
2.1.4. Điều kiện thí nghiệm 36
2.2. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 38
2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38
2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40
2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine 40
2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciences kết hợp sóng siêu âm 41
2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS 42
2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật 44
2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 45
2.3.8. Phương pháp chạy điện di 46

iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống 48
3.2. Kết quả khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 52

– Benzyladenine
MS Murashige and Skoog
LB Môi trường Luria-Bertania
B5 Môi trường B5
MSB5 Môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi
trường B5.
DNA Deoxyribonucleic acid
T-DNA transfer-DNA
GFP Green fluorescent protein
GUSA β-Glucoronidase
PEG Polymethylen glycol
PCR Polymerase chain reaction
AS
acetosyringone
Hpt hygromycine phosphotransferase
Ipt isopentenyl transferase
Hyg Hygromycin
v

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 25
Bảng 1.2: Tham khảo mặt hàng hoa cây cảnh xuất khẩu trong 10 ngày cuối tháng
07/2007 25
Bảng 3.1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 1.5% 48

Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào vào trong tế bào nhờ sóng âm. 10
Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA 11
Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens kết
hợp với sóng âm 11
Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp
cytokinin isopentenyl transferase 13
Hình 1.12: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot. 20
Hình 1.13: Hoa cẩm chướng 21
Hình 2.1: Hoa cẩm chướng 33
Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus) 33
Hình 2.3: Cây cẩm chướng in vitro 33
Hình 2.4: Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt),
gen gusA và gen ipt 34
Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 34
Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen 37
Hình 2.7: Qui trình khử mẫu 39

vii

Hình 3.1: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nhiễm ở nồng độ javel 1.5%, 3.0%, 5.0% và thời
gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 49
Hình 3.2: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ javel 3.0%, 5.0% và thời gian
khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút 49
Hình 3.3: Sự phát triển của cây sau 13 ngày ở nồng độ javel 3.0% 50
Hình 3.4: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.5: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 5.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.6: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 14 ngày 51
Hính 3.7: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi
trường tái sinh 53
Hình 3.8: Biểu đồ khảo sát số chồi tái sinh từ môi trường TS0 đến TS10. 54

các gen mang đặc tính tốt cho cây.
Một trong những yếu tố làm giảm chất lượng hoa là sự lão suy cành hoa sau
khi cắt. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khám phá ra sự lão suy cây có thể khắc
phục nhờ hợp chất cytokinin. Tuy nhiên xử lý ctytokinin từ bên ngoài có thể làm
chậm sự lão suy lá trong một số loại cây một lá mầm và hai lá mầm, chiến lược
chuyển gen sản xuất cytokinin tự điều chỉnh này được kỳ vọng có tiềm năng trong
việc làm chậm quá trình lão suy ở một phổ rộng các loại cây trồng. Đề tài “Nghiên
cứu chuyển gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Agrobacterium
tumefaciens kết hợp sóng siêu âm” với gen chuyển mục tiêu là gen ipt (isopentenyl
transferase) tổng hợp cytokinin hướng hẹn sẽ cải thiện và nâng cao chất lượng giống
cây hoa cẩm chướng. CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu


theo loại và độ tinh khiết của chất lỏng (độ bền kéo là ứng suất tối đa mà chất lỏng
có thể chịu được khi kéo). Thông thường sự tạo-vỡ bọt bắt nguồn từ những chỗ yếu
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

2

trong chất lỏng như một lỗ hổng chứa khí phân tán lơ lửng trong hệ hoặc là những vi
bọt (microbubble) tồn tại thời gian ngắn trước khi sự tạo-vỡ bọt xảy ra. Những vi bọt
này qua sự chiếu xạ của siêu âm thì sẽ hấp thu dần năng lượng từ sóng và sẽ phát
triển. Sự phát triển của bọt phụ thuộc vào cường độ của sóng. Ở cường độ sóng cao,
những bọt này sẽ phát triển nhanh thông qua tương tác quán tính. Nếu chu kỳ giãn nở
của sóng đủ nhanh, bọt khí được giãn ra ở nửa chu kỳ đầu và nửa chu kỳ còn lại là
nén bọt, nhưng bọt chưa kịp nén thì lại được giãn tiếp, cứ thế bọt lớn dần lên và vỡ.
Ở cường độ âm thấp hơn bọt khí cũng hình thành theo quá trình chậm hơn.

Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation
(Nguồn: />solids?set_language=en
,
Sonication of Biosolids)

Khi bọt phát triển tới kích thước không thể phát triển tiếp được (ở cả 2 trường
hợp cường độ sóng cao và thấp), bọt không hấp thu năng lượng được nữa, không tiếp
tục giữ được hình dạng của nó. Và dưới áp lực từ chất lỏng bên ngoài đẩy vào trong,
kết quả là bọt sẽ vỡ vào trong.
Đặc biệt trong môi trường lỏng-rắn, khi hiện tượng cavitation xảy ra gần bề
mặt phân cách lỏng - rắn thì nó khác so với trong hệ đồng thể. Ở hệ đồng thể, trong
quá trình vỡ bọt, bọt vẫn ở dạng hình cầu đối xứng. Tuy nhiên, ở ranh giới phân cách
rắn lỏng thì sự vỡ bọt ở dạng rất bất đối xứng và tạo ra một sự phun chất lỏng với tốc

công cụ chuyển gen tự nhiên đem lại hiệu quả bậc nhất.
Nguyên lý của phương pháp là Ti plasmid của vi khuẩn được cải biến cấu trúc
di truyền bằng cách cắt bỏ một đoạn dài chứa T-DNA, đồng thời gắn thêm vào một
đoạn của plasmid khác tạo nên các vector chuyển gen có kích thước phù hợp, mang
các gen giúp khả năng xâm nhiễm tự nhiên của vi khuẩn vào thực vật đồng thời
mang các gen chuyển mong muốn.
Agrobacterium tumefaciens (hình 1.2) thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hình
que, di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất. A. tumefaciens gây bệnh khối
u trên thân và rễ thực vật (hình 1.3).
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

4

Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi
(nguồn: www.bio.davidson.edu/ /method/dsmeth/ds.htm)
Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật.

plasmid.
 Vùng Vir (Virulence region) vùng độc, chứa các gen vir, giữ vai trò quan
trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen của tế bào thực vật.
Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid
(nguồn: o/students/paaras/ti_plasmid.jpg)
Gen tạo khối
Sinh tổng hợp auxin
Khởi đầu sao chép
Vùng vir
Vùng dị hóa
opine
Vùng tiếp hợp
Sinh tổng hợp
cytokinin
Sinh tổng
hợp opine
Bờ trái
Bờ phải

bào thực vật, T-DNA vòng từ Ti plasmid tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững
với bộ gen (genome) của cây.
Ở giai đoạn đầu tiên, sự kết gắn giữa Agrobacterium và tế bào cây bị tổn
thương được kiểm soát bởi hai loci “virulence” của vi khuẩn (chvA và chvB) định vị
trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, không có trên Ti plasmid. Hiện nay người ta nhận ra
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

7

rằng các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol có tính chất tín hiệu nhất
định của thực vật như acetosyringon (AS) và α-hydroxyaxetosyringon (OH-AS)
trong trường hợp cụ thể đã được ghi nhận (Stachel và cs.1985) được tiết ra bởi các
cây bị thương mẫn cảm. Các phân tử nhỏ này gây cảm ứng gen độc (vir) được mã
hóa trên plasmid Ti.
Phân tích vùng vir (regulon) của Ti plasmid thấy rằng có 6 vùng (operon) cần
cho sự dịch chuyển T-DNA đến tế bào thực vật, các loci được đặt tên là virA, B, C,
D, E, và G. Sự điều tiết của vùng vir được thực hiện thông qua sự thể hiện gen có
tính cấu trúc của virA và virG. Protein virA cần di chuyển tín hiệu AS từ vị trí kế bên
mô cây bị thương xuyên qua màng tế bào vào tế bào của A. tumefaciens. AS hỗ trợ
với protein virG kích thích sự thể hiện virB, C, D, E. Sự thể hiện các gen này cần
phải cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào cây.
Vai trò của các gen trong vùng vir như sau
 VirA mã hóa cho protein có chức năng như hóa thụ quan thực hiện vận
chuyển qua màng.
 VirG mã hóa cho protein điều hòa dương đóng vai trò thông tin đến loci của
những gen vir khác.
 VirC và virD giữ chức năng là những endonuclease tại vị trí đặc biệt trên
những trình tự lặp lại của T-DNA, tạo những sợi T-DNA mạch đơn (T-

, có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A.
tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone là hợp chất được sản sinh khi tế bào bị
tổn thương. Đây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào
tế bào thực vật. Ở nồng độ cao, acetosyringone sẽ được nhận diện bởi protein virA-
receptor trên màng vi khuẩn. Đây là một protein cần thiết để chuyển phân tử tín hiệu
acetosyringone từ vị trí kế bên mô cây bị tổn thương, xuyên qua màng tế bào, vào tế
bào của Agrobacterium. Sau khi vào tế bào của Agrobacterium, acetosyringone hoạt
động như một nhân tố có tính chất hoạt hóa virA hỗ trợ với virG-protein để kích
thích sự thể hiện virB, virC, virD, virE. Sự thể hiện các gen này cần thiết cho việc cắt
T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào thực vật. [14, 19, 29]
Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen
(nguồn:

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

9

Nhờ hoạt chất acetosyringone mà hiệu suất chuyển gen cao gấp nhiều lần.
Trong bài báo cáo của Sheikholeslam SN, Weeks DP năm 1987 với đề tài
‘Acetosyringone promotes high frequency transformation of Arabidopsis thaliana
explants by Agrobacterium tumefaciens’ đã ghi nhận với việc bổ sung acetorycinone,
hiệu suất chuyển gen là 55 đến 63% thay vì bình thường là 2-3%.


Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt)
Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào.
A, B, C, D : những tế bào được xử lý sóng âm
E, F: tế bào không được xử lý sóng âm.

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

11


hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các hợp chất mà ta mong muốn sẽ
được thực hiện.
Phương pháp SAAT mới được nghiên cứu và ứng dụng nhưng mang lại nhiều
thành công và hứa hẹn trong công nghệ chuyển gen nói chung và chuyển gen thực
vật nói riêng. [3, 12, 15, 28]
1.1.2. Đoạn gen tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc.
1.1.2.1 Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase)
Gen cần tách dòng hay còn gọi là gen cần thiết thường là những gen mã hóa
các protein, enzym hoặc gen mã hóa các đặc điểm quí (năng suất cao, khả năng
chống chịu bệnh…) cần thiết cho con người trong thực tiễn sản xuất hoặc trong
nghiên cứu.
Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ bộ
gen vi sinh vật, động thực vật, con người, hoặc tổng hợp nhân tạo các oligonucleotid.
Trong thực tế, các gen mang đặc điểm quí thường được tách chiết từ vi sinh vật hay
các sinh vật bậc cao.
Trong thí nghiệm này, đoạn gen cần tách dòng là gen tổng hợp cytokinin
isopentenyl transferase (ipt). Nghiên cứu về sinh lý đã cho thấy là trong nhiều loài,
cytokinin có thể ức chế lão suy và mức độ cytokine nội sinh đó giảm đi cùng với tiến
trình lão suy (reviewed by Gan and Amasino, 1996). Biểu hiện của gen ipt sẽ dẫn
đến việc sản xuất cytokinin. Nhiều chiến lược (với các promoter khác nhau) đã được
thực hiện để điều khiển sự biểu hiện của gen ipt trong cây chuyển gene, gồm các
promoter cảm ứng nhiệt, vết thương, sáng và những promoter đặc hiệu. Hầu hết
những cây chuyển gen cấu trúc có chứa gen ipt đều biểu hiện chậm lão suy, cũng như
có những bất thường về phát triển và phát sinh hình thái. Điều này có thể do
cytokinin tác động mạnh đến quá trình phát triển ngoài lão suy, và việc sản xuất quá
mức cytokinin trước khi lão suy xảy ra sẽ can thiệp vào sự phát triển bình thường của
cây. Để tránh vấn đề này, promoter SAG12 đặc hiệu cao cho lão suy được dùng để
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A.
tumefaciens trên đối tượng lá mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm
lượng cytokinin tăng trong cây chuyển gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá
trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen.
Isopentenyl transferase
Lão suy
Cytokinin
SAG 12 promoter
Lượng Cytokinin cao
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

14

 Năm 2003, Công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá
cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy
tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene". Hsiang Chang và cộng sự
đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây
hoa Dã yên (Petunia hybrida cv. ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A.
tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ
dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn
đối với ethylen ngoại sinh. Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể
sử dụng gen ipt trong nghiên cứu chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng
tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily…
 Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng
(Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão
suy SAG12" do Ornella Calderini và cộng sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng
tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương
pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens.