MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề:
Năng lượng đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của kinh tế- xã hội và an ninh
quốc gia. Vì vậy trong chính sách phát triển kinh tế, xã hôi thì chính sách năng lượng
cũng được đặt lên hàng đầu.
Theo tính toán của các chuyên gia kinh tế năng lượng, dầu mỏ và khí đốt chiếm khoảng
60-80% cán cân năng lượng thế giới. Với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trữ lượng dầu
mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm nữa.
Diễn biến phức tạp của giá xăng dầu gần đây là do nhu cầu dầu thô ngày càng lớn và
những bất ổn chính trị tại các nước sản xuất dầu mỏ. Để đối phó với tình hình đó, cần tìm
ra các nguồn năng lượng thay thế, ưu tiên hàng đầu cho các nguồn năng lượng tái sinh và
thân thiện với môi trường.
Trong số nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió,
năng lượng mặt trời,…) năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là các
nước nông nghiệp và nhập khẩu nguyên liệu.Trongđó Ethanol sinh học( Bio-ethnol) là
một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, là nguyên liệu thay thế xăng. Được sản xuất bằng
con đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc có
chứa tinh bột để chuyển hóa thành đường đơn. Ethanol thế hệ thứ nhất thường được sản
xuất từ các loại cây nông nghiệp có hàm lượng đường cao như : bắp( ở Mỹ), lúa mì, lúa
mạch, mía( ở Brazinl).Tuy nhiên việc phát triển Ethanol thế hệ 1 đang đối mặt với nhiều
thách thức do sự bất ổn về an ninh lương thực và hạn chế đất trồng, đồng thời chi phí
lương thực ngày càng cao. Để phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học một cách
bền vững, cả thế giới chuyển sang lựa chọn nguyên liệu thứ 2, được sản xuất từ nguồn
nguyên liệu sinh khối lignocelluloses[] . Các nguyên liệu này chủ yếu có nguồn gốc từ
chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến thực phẩm
hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh như rơm rạ,bã mía… Sinh khối lignocelluloses gồm 3
thành phần: cellulose,hemicelluloses và lignin.
Qúa trình sản xuất cồn trải qua 3 giai đoạn : tiền xử lý, thủy phân và lên men, trong đó
quá trình thủy phân đóng vai trò quan trọng. Và hiện nay phương pháp thủy phân bằng
enzyme đang được nghiên cứu rộng rãi do ít tạo các ảnh hưởng xấu đến dịch lên men và
không ăn mòn thiết bị, an toàn với môi trường. Qúa trình thủy phân cellulose trong sinh

Bã mía 40÷55% 25÷40% 5÷25%
Cỏ 25÷40% 35÷50% 10÷30%
1.1.1.Cellulose
Cellulose là nguồn tài nguyên tái tạo dồi dào nhất, bao gồm khoảng 45% trọng lượng gỗ
khô.Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
H
10
O
5
)
n,
và là thành phần chủ
yếu của thành tế bào thực vật. Cấu trúc của cellulose là polysaccharit đồng thể mạch
thẳng cấu tạo bởi các tiểu đơn vị glucose liên kết với nhau bởi các liên kết loại O-β- 1,4-
glycozit. Các mạch này được định hướng và có một đầu khử với nhóm chức hydroxyl ở
vị trí C1 tự do. Đầu còn lại là đầu không khử, nhóm chức hydroxyl ở vị trí C1 bị bao vây
trong một liên kết O-glycozit.Các mạch cellulose được nhóm lại với nhau dưới dạng vi
sợi bền bởi các liên kết hydro nội và ngoại phân tử.[3]
Hình 1.2 Công thức hóa học của cellulose
Hình 1.3 sơ đồ cấu tạo sợi cellulose
Cellulose gồm từ 1.400÷10.000 gốc β-D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-
glucozit tạo thành dạng chuỗi. Cấu trúc của cellulose bao gồm đồng thời vùng tinh thể và
vùng vô định hình. Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc, chiếm
khoảng
¾
cấu trúc cellulose. Tỷ lệ vùng kết tinh và vùng vô định hình tùy thuộc vào
nguồn gốc xuất xứ của nguyên liệu. Trong vùng tinh thể các phân tử cellulose liên kết
chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại
trong vùng vô định hình, các phân tử cellulose iên kết không chặt chẽ với nhau nên dễ

23- 32% trọng lượng khô trong các mô của cây thân gỗ. Lignin được cấu thành từ các
đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl
alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary
alcohol
Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin
Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic hydroxyl tự
do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu mạch thẳng và nhóm
carbonyl ( Hình 1.6).Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringy
Hình 1.6. Cấu trúc lignin
Sự có mặt của lignin trong sinh khối gây khó khăn cho việc thủy phân nguyên liệu thành
đường do cản trở sự tiếp xúc của cellulase với cellulose sinh khối. Do vậy phân hủy
lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả cellulose. Mặt khác, lignin lại là một trong
các nguyên liệu quý được sử dụng trong công nghiệp như nhiên liệu.Thu hồi lignin giúp
nâng cao giá trị sử dụng sinh khối thực vật.[2]
1.2.Các loại nấm mốc phân hủy lignocelluloses:
Nấm mốc phân hủy lignocelluloses có 3 loại : nấm mục nâu, nấm mục trắng, nấm mục
xốp. Trong đó, nấm mục trắng và nấm mục nâu thuộc nhóm Basidiomycetes là nhóm có
khả năng phân hủy lignocelluloses cao nhất trong tự nhiên
1.2.1.Nấm mục xốp:
Các loài nấm tạo ra mục xốp chủ yếu phân huỷ polysaccarit. Loại này không tấn công
lignin mà chỉ phân hủy cellulose, hemicellulose và tạo thành các vết mục trắng làm cho
gỗ bị xốp như bọt biển. Có thể tìm thấy chúng trên gỗ ở những nơi ẩm ướt như hàng rào,
bậu cửa, cây gỗ mục… Chúng bao gồm một số loài thuộc chi Ascomycota và một số loài
khác như Chaetomium,Ceratocystis, Lulworthia, Halosphaeria và Pleospora[4]. Các loài
nấm này phân hủy mạnh cellulases ngay từ đầu. Sợi nấm có khả năng phát triển trong lớp
của thành tế bào thực vật.
Trong nhóm nấm này,khả năng sản sinh các enzym phân huỷ cellulose cũng khác nhau.
Loài nấm có khả năng sản sinh hàng loạt enzym phân huỷ cellulose và được nghiên cứu
kỹ là T.reesei[17] T.reesei sản sinh ít nhất ba enzym endoglucanaza, hai exoglucanaza và
một hoặc hai enzym β-glucosidaza. Nhiều loại nấm mục xốp khác cũng đã được nghiên

dễ dàng khuyếch tán qua thành
tế bào thực vật và làm mục gỗ. [4]
1.3. Hệ Enzyme phân hủy lignocelluloses
1.3.1. Hệ ezyme phân hủy hemicelluloses:
Để thủy phân hoàn toàn hemicelluloses thành monosaccharides cần sự kết hợp của một
số loại enzyme. Chúng bao gồm β-D-xylanases, β- D- galactanases, β- D- mannanases.
- Các enzyme phân hủy xylan:
Để thủy phân hoàn toàn polymer xylan phân nhánh cần có một số loại enzyme khác nhau
như: endo-β- D- xylanases, β-xylosidases, α- glucuronidases, α- arabinosidases, và
acetylxylan esterases. Endo-xylanases tấn công mạch chính của xylan và các oligome
chứa nhóm thế hoặc không chứa nhóm thế, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết 1,4-
β-D-xylopyranozyl của xylan như: L- arabino-D-xylan, L-arabino-D-glucurono-D-xylan
và D-glucorono-D-xylan.
β-xylosidases có tác dụng chuyển hóa các oligome thành xylose . Enzyme nàycũng phối
hợp hoạt động với endoxylanases,α-arabinosidases và acetylxylan esterases để thủy phân
hoàn toàn xylan thành monosaccharides.
- Các enzyme phân hủy mannan:
1,4-β-D- mannoses có khả năng thủy phân liên kết 1,4-β-D-mannopyranozyl của D-
mannan và D-glacto-D-mannan
Endo-mannanase làm xúc tác cho quá trình thuỷ phân β-D-mannan thành D-manose và
hàng loạt mannooliansaccarit.
1,4-β-mannosidase ( β-D-1,4-mannozit manohydrolase) làm xúc tác cho quá trình thuỷ
phân ,tách nhóm β-D-mannozyl liên kết 1-4 khỏi phần không khử của cơ chất.Enzym này
cũng phân huỷ mannooligosaccarit và glycopeptit chứa mannose.Sự vắng mặt các enzym
này sẽ dẫn tới tich luỹ các oligosaccarit trong quá trình thuỷ phân mannan.
α-galactosidase : tồn tại rộng khắp trong vi sinh vật,thực vật và động vật.Enzym làm xúc
tác cho quá trình thuỷ phân melibiose ,metyl-,etyl-,phenyl- và o-nitrophenyl-α-D-
galactozit.Enzym này thuỷ phân α-D-galactopyranozit thông thường nhưng không giải
phóng ra D-galactose từ galactoglucomannan của gồm nhựa cây. [6]
1.3.2.Hệ enzyme phân hủy lignin:

3+
/ Mn
2+

làm cặp oxy hóa khử trung gian.Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia vào
phản ứng oxy hóa hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenol của lignin. MnP tấn
công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc oxy
hóa có trọng lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử Mn.
• Laccase(EC 1.10.3.2) là một oxidase chứa đồng. Có khả năng xúc tác phản ứng
chuyển hóa hợp chất phenol thành những phenoxyl, oxi hóa những hợp chất
không rượu trong điều kiện nhất định Đa số những nấm gây mục trắng đều có thể
sinh laccase.
• Ngoài ra còn có các enzyme phát sinh H
2
O
2
: nấm mục trắng cũng tạo ra một số
enzyme có khả năng phát sinh H
2
O
2
. Các enzyme nội bào này là glucose-1-
oxidase, glucose-2-oxidase, methanol oxidase và axyl- CoA oxidase. Các enzyme
ngoại bào phát sinh H
2
O
2
là glyoxal oxidase. Các enzyme này được
P.chrysosporium tiết ra [6]
1.3.3.Hệ enzyme phân hủy cellulose::

Ba enzyme này xúc tác cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình thủy phân cellulose tạo
glucose.[30],[39],[45]
1.4. Giới thiệu về Endo- glucanases:
1.4.1 Nguồn gốc:
Endo-β-1,4- glucanases(EC 3.2.1.4) có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau
trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất
nâahiều chủng vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn, và một số loại nấm men có khả năng sinh
tổng hợp endo-β-1,4- glucanase.
Nấm mốc là một trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Tricoderma, Penicillium,
Phanerochaete đã được nghiên cứu có khả năng tổng hợp endo- β-1,4-glucanase mạnh
như: Aspergillus niger[25], A. flavus, A. fumigates[27], Trichoderma reesei [53]…
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng có khả năng
sản sinh Endo-β-1,4- glucanases khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được
nghiên cứu là Acidothemus cellulobuticus[22]
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [23], ở
động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối , ở động vật
thân mềm như Mytilus edulis .[63]
Trong số các nguồn sinh Endo-β-1,4-glucanases như trên thì vi sinh vật được xem là
nguồn cung cấp enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật như:
- Là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn, cũng là nguồn
nguyên liệu con người có thể tạo ra được
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn ( từ 16-100 giờ)
- Vi sinh vật phát triển nhanh, tỷ lệ enzyme trong tế bào cao vì thế sản xuất chế
phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi
1.4.2. Cấu trúc không gian của enzyme endo-glucanase:
Hình 1.7: Cấu trúc không gian enzyme endoglucanase
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg
2+
(2 mM), 59% khi ủvới Cu
2+
(2 mM) [24].
1.4.3.4.Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ:
Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và
mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình
Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ
methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là
n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween
20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau,
trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [25].
1.4.4. Cơ chế xúc tác của endo- β-1,4- glucanases:
Hình 1.8 cơ chế thủy phân của celluases
Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulases tham gia thủy phân theo một cơ chế riêng.
Tuy nhiên mỗi enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn cơ chất
thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose.
Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở
bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác.
Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các
liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các
oligosaccharide, cellobiose và glucose. D-Glucosidase thủy phân các phân tử
cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose.[58]
1.4.5. Ứng dụng của enzyme Endo- β-1,4-glucanases:
1.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm:
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những hướng tiến bộ có triển vọng
nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường
chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho
dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào,

tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã được
sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5L có chứa D-glucanase sử dụng
trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi
Clostridium sinh tổng hợp glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất
dung môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [27].
1.4.5.4. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy:
Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu
hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho
quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột
hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất
vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin . Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy,
glucanase được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng
đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh
1.4.6. Một số nghiên cứu
1.4.6.1. Một số nghiên cứu về các chủng sinh enzyme endoglucanase
Bảng 1.3 : Một số nghiên cứu về enzyme endo- glucanase
Nguồn gốc
enzyme
Khối lượng(Dalton) pH Nhiệt độ(°C)
Tài liệu tham khảo
A.niger 26.000 4.0 4.5 Theo Hurt( 1997)
Ruminococcu
s albus
_ 5.8 47
Leathrewood(1965)
Clostridium
thermocellum
76.000 7.0 70
[1]
Actinomyces

Máy lắc ổn nhiệt Shellab , Mỹ
Và một số thiết bị khác
2.3. Hóa chất :
+ Môi trường Crapex
Thành phần Số lượng(g/l)
Saccarose 30
NaNO
3
3
KH
2
PO
4
.7H
2
O 1(1.3255)
MgSO
4
.7H
2
O 0.5(1.025)
KCl 0.5
FeSO
4
0.01(0.0182)
Aga 20
Kháng sinh 0.1
+ Môi trường cấy chuyển sử dụng cơ chất đặc hiệu (CMC):
Thành phần Số lượng(g/l)
NaNO

2
MgSO
4
0.3
CaCl.2H
2
O 0.3
Pepton 1
Cao nấm men 0.5
Tween 80 1ml
Oligo 1ml
Đệm citrat pH 4
2.4. Các phương pháp nghiên cứu :
• Sơ đồ phân lập và tuyển chọn :
Cân
Đục thạch nuôi lỏng trên MT Crapek

Phân lập nuôi trong môi trường Crapek ở 30°C trong 2-3 ngày
Cân
Tách khuẩn lạc cấy chấm điểm trên MT Crapek chứa cơ chất CMC
Nuôi lỏng trong MT Crapek ở 50°C, 5 ngày
Thu dịch enzyme
Xác định hoạt độ enzyme( phương pháp đo đường kính thủy phân)
Cấy thu bào tử
Thu dịch enzyme
Tuyển chọn và bảo quản giống
Mẫu
2.4.1. Phương pháp phân lập
Mẫu pha loãng từ 10
-1