TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
LÊ KIM TRONG
ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM
DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM
DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012
i
ii
TÓM TẮT
Thí nghiệm cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV đƣợc thực hiện
nhằm tìm hiểu những biến đổi mô bệnh học ở cơ quan gan tụy tôm và một số
chỉ tiêu miễn dịch dƣới ảnh hƣởng của Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin
và sự cảm nhiễm WSSV. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 5 nghiệm thức gồm
nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức có nồng độ Decis 0,001 µg/L có tiêm
0,1 ml WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,01 µg/L có tiêm WSSV sau 24
giờ, nồng độ Decis 0,1 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ và nghiệm thức chỉ
tiêm WSSV sau 24 giờ. Kết quả thu mẫu đƣợc ở thời gian 0 giờ, 24 giờ và 48
giờ sau khi gây cảm nhiễm, sau khoảng 54 giờ tôm chết ở các nghiệm thức có
Decis và WSSV. Các chỉ tiêu phân tích miễn dịch máu tôm kết quả cho thấy
giá trị tổng bạch cầu giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiêm WSSV. Giá trị
của RES ở các nghiệm thức có Decis và WSSV tăng dần qua 24 giờ và 48
giờ, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ so với lúc 0 giờ. Giá trị SOD ở
các nghiệm thức có nồng độ Decis khác nhau tăng khác biệt có ý nghĩa ở 24
giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV, riêng nghiệm thức chỉ tiêm
WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ và khác biệt có ý nghĩa
lúc 48 giờ so với 0 giờ. Giá trị PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
PHẦN II 3
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Phƣơng pháp mô học 3
2.2 Sơ lƣợc các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm. 4
2.3 Sơ lƣợc những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm 6
2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác. 6
2.4.1 Quá trình thực bào 7
2.4.2 Quá trình phong tỏa 7
2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO) 8
2.4.4 Chất chống oxy hóa 8
2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn 8
2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hƣởng đến động vật thủy sản 8
2.5.1 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên cá 8
2.5.2 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên tôm 9
2.6 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 10
2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis 11
2.6.2 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu 12
PHẦN III 13
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 13
3.2 Vật liệu nghiên cứu 13
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13
3.2.2 Dụng cụ 13
3.2.3 Hóa chất 13
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13
3.3.1 Phƣơng pháp nuôi dƣỡng tôm 13
Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 15
Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lƣợng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm thức
và các ngày thu mẫu. 20
Hình 4.2 Biểu đồ so sánh hoạt tính Respiratory burst của tôm sú giữa các
nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu. 21
Hình 4.3 Biểu đồ so sánh hoạt tính superoxide dismutase của tôm càng xanh
giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu 22
Hình 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các
nghiệm thức và các ngày thu mẫu. 23
Hình 4.5 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm sú bình thƣờng ở mặt cắt ngang
(H&E) Mẫu nghiệm thức đối chứng 23.
Hình 4.6 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm càng xanh bình thƣờng ở mặt cắt
ngang. 24
Hình 4.7 Cơ quan gan tụy tôm sú bị hoại tử mất cấu trúc ( ) (10X) 25
Hình 4.8 Các tế bào máu bao xung quanh ống gan tụy bị hoại tử (40X) 25
Hình 4.9 Thể vùi WSSV trên tôm sú (100X). 26
Hình 4.10 Gan tụy tôm càng xanh bị hoại tử (10X). 26
Hình 4.11 Sợi mang tôm càng xanh sƣng phồng ( ), sợi mang bình thƣờng
( )(10X). 27
1
PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1Giới thiệu
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích có khả năng
nuôi trồng thủy sản khoảng 1,1 triệu ha, là vùng nuôi thủy sản trọng điểm
chiếm 55% tổng diện tích nuôi của cả nƣớc (Đào Bá Cƣờng, 2010). Trong đó
diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 550.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Cà
Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh và Bến Tre (Cục NTTS,
chi phí thuốc, hóa chất ngƣời nuôi đã sử dụng thuốc trừ sâu để diệt tạp, giáp
xác và kích thích tôm lột xác. Trong đó thuốc trừ sâu Decis chứa hoạt chất
Deltamethrin đƣợc đƣợc ngƣời nuôi sử dụng khá phổ biến (Nguyễn Hữu Đức,
2007). Độc tính của Deltamethrin thƣờng gây chết sinh vật ở nồng độ rất
thấp.
2
Hiện nay đã có một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của Deltamethrin đối
với đặc điểm sinh lý, sinh trƣởng của tôm và cá nhƣng nghiên cứu về đặc
điểm mô học thì chƣa có. Chính vì vậy, đề tài “Đặc điểm mô bệnh học gan
tụy của tôm dƣới tác động của nông dƣợc” đƣợc thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Tìm hiểu những biến đổi mô học gan tụy của tôm dƣới tác động của
thuốc trừ sâu Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin.
1.3 Nội dung đề tài
- Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của Deltamethrin lên tôm ở
nhiều nồng độ khác nhau.
- Xác định những biến đổi mô học của gan tụy dƣới ảnh hƣởng của
Deltamethrin.
và hình ảnh mô thu thập qua phân tích đem đối chiếu với CD hƣớng dẫn các
phƣơng pháp chuẩn đoán bệnh tôm sú do FAO & Multimedia Asia Co.Ltd
phát hành năm 1999 (Phạm Trần Nguyên Thảo & ctv, 2004).
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) mô bệnh học là phƣơng pháp xác
định các tổn thƣơng ở các mô tế bào dựa trên những thủ thuật nhuộm tế bào
và quan sát dƣới kính hiển vi. Phƣơng pháp này cho phép ngƣời phân tích kết
luận tính chất của các vùng bị tổn thƣơng. So sánh và đối chiếu với các kết
quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có một chẩn đoán đúng.
Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thƣơng bên ngoài mà không có các dữ
kiện khác liên quan đến tôm cá bệnh thì thƣờng có những kết luận sai lầm vì
những hình thái tổn thƣơng của vài bệnh có thể giống nhau và gây lầm lẫn
trong chẩn đoán. Phƣơng pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển
vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phƣơng thức mô học đề cập
tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng
trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trƣờng hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán
đƣợc bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên nó có những hạn chế nhất định, thao
tác chậm. Phƣơng pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu
về môi trƣờng và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh.
Một số ứng dụng của mô học (trích dẫn từ Nguyễn Thùy Ngân, 2008).
Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong
việc hệ thống bệnh thƣờng gặp trong nuôi tôm Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et
al., 1992). Thời gian sau Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của
virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc
quan sát tiêu bản mô học dƣới kính hiển vi quang học và điện tử. Năm 1998
Sudha và ctv bằng phƣơng pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các
loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển Ấn Độ. Nguyễn Văn Hảo (1999)
nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phƣơng pháp mô học
và PCR, bằng việc kết hợp hai phƣơng pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc
điểm mô học của các tác nhân gây bệnh trên tôm sú, năm 2000 ông cũng ứng
dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu đề tài bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ.
có biểu hiện: khối gan tụy teo lại từ ít đến hoàn toàn của tuyến niêm mạc và
sự hình thành các dạng vi khuẩn thông qua các tiêu bản mô. Xảy ra hiện
tƣợng viêm hồng cầu trong lòng các tuyến để phản ứng lại hoại tử, tiêu hủy tế
bào và hiện tƣợng lột vỏ tế bào biểu mô tuyến gan tụy. Biểu mô tuyến gan tụy
bị teo lại rõ rệt, tạo nên vùng bị phù thủng rộng trong gan tụy. Chúng chứa ít
hoặc không còn chứa các giọt lipid, giảm đáng kể hoặc không còn các không
bào.
Theo Hoàng Tuấn (2007) xác định mầm bệnh virus phân lập trên tôm sú
(Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng cho kết quả thấy có sự xuất hiện
MBV và HPV trên mẩu phân tích và sự xuất hiện của MBV cao hơn so với
HPV. Tuy nhiên dấu hiệu biểu hiện bệnh trên tiêu bản mô học tƣơng đối
giống nhau là tạo thể vùi trong nhân (đối với HPV) hoặc thể ẩn (đối với
MBV) trên một cơ quan gan tụy.
Theo Hoàng Quốc Trung Tuấn (2007) khi tôm bị nhiễm HPV không có
dấu hiệu đặc trƣng, nhƣng nếu tôm nhiễm nặng thì gan có màu hơi trắng. Ở
giai đoạn đầu gan tụy phì đại nhƣng về sau teo lại nhỏ hơn bình thƣờng. HPV
chỉ nhiễm chủ yếu ở ở tế bào E nằm ở đỉnh đầu của ống tiểu quản gan tụy,
5
HPV làm cho các nhân trong tế bào biểu mô gan tụy hoại tử dƣới hình thức
tạo thể vùi trong nhân phì đại, sự phát triển thể vùi trong nhân làm chuyển đổi
vị trí hạch nhân. Thông thƣờng HPV chỉ tạo 1 thể vùi trong nhân phì đại
nhƣng đôi khi có thể quan sát thấy 2 thể vùi trong nhân phì đại. Giai đoạn đầu
thể vùi bắt màu kiềm nhẹ, kích thƣớc nhân phì đại tƣơng đối nhƣng về sau thể
vùi bắt màu kiềm đậm hơn và nhân phì đại chiếm gần hết thể tích của tế bào.
Một số biến đổi mô học của tôm sú bị nhiễm HPV thu ở ĐBSCL giống với
các nghiên cứu của Lightner (1994), Flegel et al., (2000), Chayaburakul et al.,
(2004) là tạo thể vùi trong nhân biểu mô gan tụy và đặc biệt là tế bào phôi. Số
lƣợng thể vùi do bệnh HPV tạo ra (1-2) thấp hơn thể ẩn MBV (5-7). HPV bắt
màu tím của Haematoxylin, thể ẩn MBV bắt màu hồng của Eosin, HPV có
kích thƣớc lớn hơn MBV.
trùng (vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei) kí sinh trong tế bào chất của tế
bào gan tụy. Nghiên cứu về tình hình tôm chết hàng loạt ở tỉnh Sóc Trăng và
Bạc Liêu. Mẫu tôm bệnh thu vào tháng 8/2010 ở các tỉnh: Hải Phòng, Nghệ
6
An, Thừa Thiên Huế, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau. Tôm bệnh
có dấu hiệu hoạt động yếu, tấp bờ, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% trong 2-3
ngày, gan tụy tôm bệnh nặng bị hoại tử, khi tôm yếu và chết gan tụy thối rữa
rất nhanh. Bằng các phƣơng pháp chuẩn đoán mô bệnh học, kính hiển vi điện
tử, sinh học phân tử trên tôm bệnh có các biểu hiện: gan tụy bị hoại tử và có
thể chứa các giọt mỡ, một số tế bào trên mô hình ống trƣơng to chứa đầy các
hạt nhỏ, nhân phân hóa, tôm hầu nhƣ không bị nhiễm những bệnh do virus
(MBV, WSSV, YHV, HPV,…) nhƣng trong tế bào gan tụy của tôm có chứa
các bào tử trƣởng thành. Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh ở
tôm sú là vi bào tử thuộc giống Enterocytozoon, họ Enterocytozoonidae kí
sinh nội bào.
2.3 Sơ lƣợc những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm
Theo Flegel và ctv. (1997) bệnh đốm trắng do tác nhân white spot
syndrome virus (WSSV) gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất và
gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm trên thế giới. Đây
là bệnh lây trên các loài tôm thuộc họ Penaedae.
Theo Lightner (1996) cơ quan đầu tiên và cũng là cơ quan đích mà
WSSV tấn công là lớp biểu mô mang bao gồm: biểu mô dƣới vỏ, biểu mô dạ
dày và biểu mô mang. Trong trƣờng hợp nhiễm cấp tính tôm không có biểu
hiện bệnh lý rõ ràng, chỉ thấy tôm lờ đờ và giảm ăn. Sau khi tôm bị nhiễm
WSSV có dấu hiệu giảm ăn 1 – 2 ngày thì hiện tƣợng tôm chết bắt đầu xảy ra
và từ 3 – 10 ngày tỉ lệ tôm chết lên đến 100%.
Phạm Trần Nguyên Thảo (2003), ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong
chẩn đoán bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Kết quả là khi tôm bị bệnh
đốm trắng ở mức độ vi thể thì thấy thể vùi trong nhân phì đại ở các tế bào
biểu mô dạ dày, dƣới da và mang.
Hoạt hóa hệ
thống ProPO
Không hạt
Có
Không
Chƣa biết
Không
Bán hạt
Hạn chế
Có
Có
Có
Có hạt
Không
Rất hạn chế
Có
Có
Bạch cầu là loại tế bào máu có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn
dịch của giáp xác. Bạch cầu gồm có 3 loại: bạch cầu không hạt, bạch cầu bán
hạt và bạch cầu có hạt. Mỗi loại có một chức năng riêng và chức năng chung
của 3 loại bạch cầu là sự đông tụ, thực bào và tạo melanin bằng hệ thống
Prophenoloxydase (proPO).
Ngoài các cơ chế đáp ứng miễn dịch tƣ nhiên tƣơng tự nhƣ ở động vật
có xƣơng sống, một số cơ chế khá đặc thù ở giáp xác bao gồm: hình thành
khối u, khả năng phong bế, khả năng sản sinh các protein kháng khuẩn (còn
gọi là các peptit kháng khuẩn), phản ứng đông máu có thể bị kích thích bởi
lipopolysaccharide (LPS) của vi khuẩn, khả năng sử dụng các enzym thủy
phân, các chất kháng với nguyên sinh động vật và đặc biệt là hệ thống
Phenoloxydase (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phƣơng, 2007).
2.4.1 Quá trình thực bào
hóa bởi sự ô nhiễm, sự nhiễm bệnh, sự giảm hoặc tăng oxy trong cơ
thể…(Neves et al., 2000)
2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn
Pepit kháng khuẩn (AMPs) là một dạng đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở
động vật không xƣơng sống, chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng độc tố…
Peptit kháng khuẩn là những protein cation có trọng lƣợng phân tử thấp.
Những peptit này có khả năng tƣơng tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật
tạo nên những lỗ thủng, gây mất sự ổn định các ion và năng lƣợng của vi sinh
vật. (Marshall và Arenas, 2003)
2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hƣởng đến động vật thủy sản
2.5.1 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên cá
Theo Murty (1985) đƣợc trích dẫn từ Lê Quốc Việt (2002) các loại hóa
chất có gốc clo hữu cơ độc với cá hơn các loại hóa chất có gốc phosphat hữu
cơ. Mỗi loài cá có khả năng chịu đựng khác nhau đối với chất độc, cá rô phi
(Oreochromis niloticus) chịu đựng Methy parathion (MP) tốt hơn cá Chép
(Cyprinus carpio). Thuốc trừ sâu gốc chlor hữu cơ ở nồng độ dƣới mức gây
chết kích thích quá trình tiêu thụ oxy nhƣng ở mức gây chết lại ngăn cản quá
trình lấy oxy của cá. Đối với thuốc gốc lân hữu cơ làm suy giảm tiêu thụ oxy
của cá liên tục.
Theo Nguyễn Thanh Phƣơng và Đỗ Thị Thanh Hƣơng (1997) cá rô phi
(Oreochromis niloticus) giống sau khi tiếp xúc với môi trƣờng có thuốc
Methy parathion (MP) ở nồng độ thuốc 17mg/L và 24mg/L dần dần bị bất
9
động và chìm xuống đáy bể sau 2 giờ; 1-2 giờ sau cá di chuyển lên mặt nƣớc
đớp khí, sau đó hoạt động yếu dần và bắt đầu chết.
Các số liệu đƣợc trích dẫn từ Phƣơng Ngọc Tuyết (2009). Giá trị LC
50
-
96 giờ của cá rô phi (Guineesis) đối với Deltamethrin là 0,002µg/L và tỉ lệ
chết tăng dần khi cá tiếp xúc với nồng độ cao và thời gian kéo dài. Theo
Saponin lên một số loài tôm cá, đã nhận định rằng tôm càng xanh có sức chịu
đựng cao nhất rồi đến tôm sú và tôm thẻ. Giá trị LC50-96 giờ của Saponin đối
với tôm thẻ là 1,03 mg/L, tôm sú là 1,59 mg/L, tôm càng xanh là 1,89 mg/L
Theo Lignot et al., (1997) giá trị LC
50
-96 giờ ở từng giai đoạn tôm he
Nhật Bản (Penaeus japonicus) đối với thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ
(Fenitrothion) nhƣ sau PL1 là 1,8µg/L, PL5 là 0,6µg/L, PL7 là 0,3µg/L, PL15
là 0,4µg/L và ấu niên là 0,8µg/L.
Theo Lê Quốc Việt (2002) giá trị LC
50
-96 giờ của Dipterex, BKC,
formalin đối với tôm sú (P
30
) lần lƣợt là 0,021 ppm; 1,45 ppm; 36,87 ppm.
Giá trị LC
50
-96 giờ của Dipterex thấp hơn rất nhiều lần so với BKC và
formalin. Tôm có biểu hiện ngộ độc nhanh với BKC và chậm nhất là
Dipterex, nhƣng sau 12 giờ thì độc tính của BKC giảm đáng. Khi mới ngộ
độc tôm bơi lội và búng lên mặt nƣớc, lờ đờ, sau đó tăng cƣờng hô hấp và
tôm suy yếu dần.
Theo Chang et al., (2006) đƣợc trích dẫn từ Ngô Thanh Toàn (2009) giá
trị LC
50
của Chlor hữu cơ Trichlorfon đối với tôm càng xanh ở 24, 48, 72 và
96 giờ lần lƣợt là 0,7739; 0,3513; 0,2697 và 0,2555µg/L. Ở nồng độ dƣới
ngƣỡng gây chết, Trichlorfon làm ảnh hƣởng đến sinh lý, sinh hóa của tôm
càng xanh, sau 24 giờ tiếp xúc với Trichlorfon ở nồng độ 0,1-0,3µg/L, hoạt
tính acetylcholinesterase, glycogen, Na
nồng độ Diazinon, sau 4 ngày thay nƣớc tôm bắt mồi bình thƣờng trở lại.
Tôm chậm lột xác hơn lô đối chứng khi nồng độ Diazinon lớn hoặc bằng
97,5µg/L và tốc độ tăng trƣởng tƣơng đối của tôm bị ức chế 33,47% ở nồng
độ lớn hơn hoặc bằng 195µg/L.
Theo Phƣơng Ngọc Tuyết (2009). Dƣới ảnh hƣởng của Deltamethrin
tôm tập trung lột xác ở nồng độ 0,75-1,25µg/L sau 24 giờ. Giá trị LC
50
-48 giờ
của tôm sú đối với Deltamethrin là 1,18µg/L, LC
50
-96 giờ là 1,05µg/L do đó
sử dụng Deltamethrin để kích thích tôm lột xác là cách không phù hợp vì có
thể gây chết tôm. Nồng độ Deltamethrin 0,01µg/L và 0,52µg/L ảnh hƣởng
đến điều hòa áp suất thẩm thấu và ion (Na
+
, K
+
và Cl
-
) của tôm sú ở độ mặn
15%o và 35%o, ở độ mặn 25%o không làm ảnh hƣởng đến khả năng điều hòa
áp suất thẩm thấu và ion Na
+
, Cl
-
nhƣng làm ảnh hƣởng đến điều hòa ion K
+
.
Tôm sống trong môi trƣờng nƣớc có nhiễm Deltamethrin nhở hơn hoặc bằng
0,52µg/L ở độ mặn 25%o thì mất năng lƣợng ít hơn ở độ mặn 15%o và 35%o.
ctv, 2007)
2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis
- Tên thông thƣờng của Decis: Deltamethrin (ISO, BSI)
- Tên thƣơng mại: deltamethrin, Decis®, K-Othrin®, NRDC 161, OMS
1998, RU-22974.
- Nhóm hóa học: pyrethroid (nhóm họ cúc)
- Tên hóa học: (s)-α-[14C]cyano-3-phenoxybenzyl-(1R,3R)-3-(2,2-
dibromo-vinyl)-2,2-dimethyl-cyclopropane-carboxylate.
- CTPT: C
22
H
19
Br
2
NO
3
- CTCT:
- Tính chất lý và hóa học: Decis 2,5EC là loại thuốc thuộc nhóm cúc
tổng hợp (Pyrethroid) ở dạng bột tinh thể với nhiệt độ nóng chảy 98-
100
o
C, không màu, không vị. Hoạt chất không tan trong nƣớc, dễ tan
trong aceton, cồn, dioxan và các dung môi nhân thơm khác. Decis
tƣơng đối bền với nhiệt độ, nó không bị phá hủy ở nhiệt độ (40
o
C
13 PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
- Địa điểm : Các phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học & Bệnh Thủy
Sản, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
14
vào bể. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẩu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần, mỗi bể bố trí 30 con tôm.
Thu mẫu lúc 0h, thu ngẫu nhiên 3 con ở 3 bể khác nhau. Sau đó cho
Decis vào bể ở các nồng độ khác nhau cho mỗi nghiệm thức. Sau khi thu mẫu
lúc 24h tiến hành tiêm 0,1ml WSSV vào mỗi con tôm.
Theo dõi lƣợng tôm chết và tiến hành thu mẫu sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
và 96 giờ bằng cách chọn ngẫu nhiên 3 con từ mỗi bể. Máu dùng để phân tích
các chỉ tiêu miễn dịch, phần đầu tôm cố định trong dung dịch Davidson’s
AFA để phân tích mô học. Thí nghiệm đƣợc bố trí với các nồng độ Decis nhƣ
sau:
1. Nghiệm thức Đối chứng
2. Nghiệm thức I: 0,001 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ
3. Nghiệm thức II: 0,01 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ
4. Nghiệm thức III:0,1 µg/L + 0,1 ml WSSV sau 24 giờ
5. Nghiệm thức IV: Không có Decis, tiêm 0,1ml WSSV sau 24 giờ
3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm
- Thuốc trừ sâu Decis 2,5EC, thuốc chứa 25g/L hoạt chất Deltamethrin và
975g/L chất phụ gia.
- Thuốc đƣợc chuẩn bị bằng cách pha dung dịch mẹ có nồng độ 2.500µg/L.
Dung dịch mẹ đƣợc sử dụng để pha thành các nồng độ thí nghiệm dựa vào
thể tích nƣớc trong bể thí nghiệm.
Áp dụng công thức: C
1
V
1
= C
2
V
2
C
2
là nồng độ thuốc trừ sâu Decis
V
2
là thể tích thuốc trừ sâu Decis.
Áp dụng công thức trên để pha các nồng độ 0,001 µg/L, 0,01 µg/L,
0,1µg/L cho thí nghiệm với bể 200L có chứa 50L nƣớc.
3.3.4 Phƣơng pháp phân tích miễn dịch
3.3.4.1 Tổng tế bào máu
15
- Tổng số bạch cầu đƣợc đếm theo phƣơng pháp của Le Mollac et al. (1997)
điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv. (2011)
- Máu tôm đƣợc thu bằng cách dùng kim tiêm vô trùng có chứa 900µl dung
dịch chống đông rút 100µl máu.
- Mật độ tế bào máu đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát
dƣới kính hiển vi (40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 buồng
đếm (vùng kí hiệu chữ C), đƣa vào giữa thị trƣờng, chuyển sang vật kính
40X (Hình 3.1 ). Đếm 2 lần lặp lại
Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu
Cách tính tổng tế bào máu: TBC = C x 10 x 5 x 10 (tb/mm
3
) (Trong đó C
là tổng số tế bào máu trên 5 vùng đếm).
3.3.4.2 Hoạt tính của Phenoloxidase (PO)
Hoạt tính của Phenoloxidase xác định theo phƣơng pháp của Herández-
phenol red).
- Để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ zymosan.
- Tế bào máu đƣợc rửa 3 lần với 100µl Hanks’ solution.
- Nhuộm với 100 µl NBT solution (0,3%) trong 30 phút ở nhiệt độ
phòng. Loại bỏ NBT solution, tế bào máu đã đƣợc cố định.
- Rửa 3 lần với 100 µl methanol 70%, để khô.
- Hòa tan bằng cách thêm vào 120 µl KOH 2M và 140 µl dimethyl –
sulphoxide.
- Đo 3 lần ở bƣớc sóng 630 nm bằng Microplate reader.
3.3.4.4 Hoạt tính của Superoxide dismutase (SOD)
Hoạt tính của Superoxide dismutase đƣợc xác định theo phƣơng pháp
của Beauchamp và Fridovich (1971) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv
(2011).
- Cho 100 µl dung dịch máu vào 1 ống eppendorf lạnh có chứa 500 µl
phosphate buffer (50mM, pH 7,8).
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Chuyển phần dịch phía trên sang 1 ống eppendorf mới. Ủ 5 phút ở
65
o
C.
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
o
C. Chuyển phần dịch phía
trên sang 1 eppendorf mới và trữ ở -20
o
C.
- 2 ml dung dich SOD và từ 100µl dịch chiết tách thô đƣợc so màu bằng
máy so màu quang phổ ở bƣớc sóng 560nm.
C) bằng cách chuyển mẫu qua nhiều lọ paraffin.
Quy trình xử lý mẫu mô đƣợc cài đặt trong máy xử lý mô tự động
(microm, STP 120-2) qua các bƣớc sau:
Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động
Sau khi hoàn thành các bƣớc cài đặt chƣơng trình xử lý mô thì tiến hành cho
sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và tiến hành quy trình xử lý.
3.3.5.4 Đúc khối
Chuyển cassette chứa mẫu đã đƣợc xử lý vào khoang chứa paraffin nóng
chảy trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút. Mẫu mô
STT
Hóa chất sử dụng
Thời gian
1
Cồn 80%
20 phút
20 phút
30 phút
Paraffin + sáp ong (7:3)
Copyright: Tài liệu đại học ©