MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Giống thằn lằn bóng Mabuya Fitzinger, 1826 thuộc họ Thằn lằn bóng
(Scincidae) trong lớp Bò sát (Reptilia) là một trong số các loài thằn lằn phân bố
rộng rãi ở vùng nhiệt đới [9], Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của 2 loài
thằn lằn bóng giống Mabuya Fitzinger, 1826 (M. longicaudata, M.
Multifasciata) ở Thừa Thiên Huế]. Theo Miralles A. và cs (2005), giống
Mabuya có khoảng hơn 110 loài phân bố khắp châu Phi, châu Á và châu Mỹ
[22]. Dựa trên những nghiên cứu gần đây trên lĩnh vực sinh học phân tử, loài
này được chia chính thức thành bốn giống (Mausfeld et al., 2000, 2002;
Mausfeld và Schmitz, 2003). Giống Mabuya ở châu Á được thay bằng
Eutropis Fitzinger, 1943. Giống Afro-Malagasy được đăng ký dưới tên
Euprepis Wagler, 1830. Giống thằn lằn bóng ở đảo Cape Verde chính thức là
giống Chioninia Gray, 1845 và giống ở Nam Mỹ là Mabuya Fitzinger, 1826
[19].
Ở Việt Nam thằn lằn bóng phân bố ở hầu hết các tỉnh ở nước ta từ Lai
Châu đến Bạc Liêu [Nguyễn Văn Sáng (2005), Danh lục bò sát và ếch nhái
Việt Nam]. Theo thống kê tại vùng Nam Bình Trị Thiên có đến 102 loài
lưỡng cư và bò sát, trong đó họ thằn lằn bóng là loài có mức độ phân bố khá
cao với 8 loài [3].
Thằn lằn bóng được biết đến khá lâu với các giá trị về dược học và thực
phẩm. Thịt thằn lằn bóng không chỉ thơm ngon mà còn có giá trị dinh dưỡng
cao, tác dụng tốt đối với một số bệnh như suy dinh dưỡng, khó thở, nhức
mỏi xương khớp… Tuy nhiên ngày nay, cùng với sự đô thị hóa, mở rộng các
1
khu dân cư và sự khai thác quá mức đã làm cho số lượng thằn lằn bóng ngày
càng suy giảm.
Trên thế giới đã có các công trình nghiên cứu về thằn lằn bóng, tuy
nhiên tại Việt Nam việc nghiên cứu chủ yếu tập trung về hình thái, sinh thái
[3], [4], [9], [14], chưa thấy có công bố nào về đặc điểm di truyền của thằn
lằn bóng.
6. Tính mới của đề tài
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về đa dạng di truyền của loài
thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vài nét về thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820
1.1.1. Hình thái
Loài Eutropis multifasciata là loài thằn lằn bóng phân bố rộng rãi khắp
Châu Á. Về ý nghĩa tên loài “multi” nghĩa là nhiều, “fasciata” có nghĩa là
dải, do đó tên loài dựa trên các dải màu hình thành dọc thân thằn lằn bóng.
Mô tả: cơ thể có kích thước trung bình. Đầu phủ vảy tấm đối xứng, ít
phân biệt với cổ. Mõm tù, tấm mõm rộng hơn cao. Lỗ mũi tròn, nằm giữa
tấm mũi, 2 tấm trên mũi cách nhau bởi tấm trán-mũi và tấm trán. Có một cặp
tấm gáy tiếp xúc nhau, đôi khi ngăn cách bởi một vảy nhỏ. Có 2 tấm má, 4
tấm trên ổ mắt, 6-7 tấm trên mí mắt.Có 1-2 vảy trước trên ổ mắt, đôi khi
không có, 2 vảy trước dưới ổ mắt, 8-10 vảy sau ổ mắt, 1 vảy sau- trên ổ mắt.
Có 6-7 tấm mép trên, 7-8 tấm mép dưới mỗi bên. Có 3 hàng vảy thái dương.
Tấm cằm rộng hơn cao, một tấm sau cằm lẻ, rộng hơn dài, 2 cặp tấm sau
cằm, cặp thứ nhất tiếp xúc nhau, cặp thứ hai thường cách nhau bởi 1 vảy
nhỏ. Màng nhĩ sâu, cao hơn dài một chút.
Vảy thân tương đối đồng đều, xếp theo hình ngói lợp từ trước ra sau.
Vảy trên lưng có 3 gờ rõ (đôi khi có 5 gờ), vảy phía bên có gờ yếu hơn, vảy
bụng nhẵn. Có 30-33 hàng vảy xung quanh giữa thân kể cả vảy bụng, 39-46
hàng vảy dọc lưng, 46-54 hàng vảy dọc bụng, 68-94 hàng vảy dưới- giữa
đuôi. Vảy ở các chi nhỏ hơn vảy thân. Vảy chi trước nhẵn, vảy chi sau ở mặt
trên có gờ yếu mặt dưới không có gờ. Chi trước có 6-8 bản mỏng dưới ngón
I, 11-14 bản mỏng dưới ngón III, 11-15 bản mỏng dưới ngón IV. Chi sau có
6-9 bản mỏng dưới ngón I, 13-17 bản mỏng dưới ngón III, 15-19 bản mỏng
dưới ngón IV.
Ảnh hưởng của ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm: hoạt động sống của M.
multifasciata mạnh nhất trong điều kiện nắng ấm, nhiệt độ 30-35°C, độ ẩm
70-80%.
E. multifasciata phân bố hầu hết các vị trí trong địa điểm nghiên cứu.
Tuy nhiên, gặp phổ biến nhất ở cây bụi, hang đá - bê tông, bờ sông, bụi tre,
bờ mương, đống gạch, ngói vỡ. Môi trường sống của loài này thường ở khu
vực dân cư, các công viên, khuôn viên trường học và cơ quan, bãi cát ven
biển, đầm phá, khu vực ven sông, hồ, bãi cỏ.
Eutropis multifasciata chủ yếu ăn ấu trùng của côn trùng (13,77 %), bộ
Cánh thẳng (13,17 %), bộ Cánh màng (11,68 %), bộ Cánh phấn (8,68 %).
Bảy loại chiếm ưu thế trong thành phần thức ăn của E. multifasciata: ấu
trùng côn trùng, Kiến, Nhện, Mọt ẩm, Cào cào, Mối, Bướm cải.
Xiang & cs. (2006) cho biết loài Mabuya multifascisata cái sinh sản lúc
thân dài 90 mm. Cá thể đực trưởng thành có thân dài 117 mm và cá thể cái
thân dài là 116 mm. Sự sinh con bắt đầu vào tháng 5, không thấy có sự liên
quan giữa kích thước cơ thể và số con đẻ [24]. Nhiệt độ môi trường thời kỳ thai
nghén tác động đến ngày sinh nhưng không tác động đến kích thước ổ đẻ và
6
khối lượng ổ đẻ. Mabuya bistriata đạt đến độ chín sinh dục gần hết năm thứ
nhất của đời sống, con cái sinh sản lứa đầu tiên lúc một năm tuổi [35].
1.1.3. Vai trò
+Về sinh thái: Thằn lằn bóng tham gia vào nhiều chuỗi thức ăn và lưới
thức ăn của các hệ sinh thái ở cạn. Chúng là mắt xích quan trọng góp phần
chuyển hóa vật chất và năng lượng, đảm bảo cân bằng trong các hệ sinh thái.
+ Về nông, lâm nghiệp: Thằn lằn bóng là một thiên địch có lợi, chúng
ăn nhiều loài động vật gây hại như: Châu chấu, rầy, bọ Cánh cứng, sâu, mối
gián, Góp phần bảo vệ vật nuôi, cây trồng.
+ Về dược liệu: Thằn lằn bóng là một vị thuốc có tác dụng chữa được
một số bệnh. Người dân vẫn hay dùng Thằn lằn bóng để chữa bệnh hen
suyễn, biếng ăn ở trẻ em [11].
loài trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp của các nucleotide.
Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [17].
Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước từ
5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học. Tuỳ theo hãng sản xuất, các
mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau. Yêu cầu cơ bản là
mồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA
nằm giữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên. Mồi
càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng
nhiều. Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân
đoạn PCR càng ít đi.
Các bước thực hiện: gồm bốn bước cơ bản sau
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch và đánh giá độ tinh sạch của DNA tổng số
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với primer ngẫu nhiên
8
- Bước 3: Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide
- Bước 4: Phân tích và đánh giá kết quả đa dạng di truyền bằng các phần
mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster) các số liệu thu được cho thấy
sự gần gũi hoặc tách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm
và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống
động vật, thực vật và vi sinh vật [17]. Kỹ thuật chỉ cần một lượng DNA nhỏ
làm khuôn, không đòi hỏi phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều
locus cùng lúc do đó phân tích được lượng mẫu lớn. Đồng thời RAPD không
dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong
phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ (variety) cây
trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại.
RAPD cũng có một số hạn chế như sau: có tính trội (dominant) do đó
khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử. Có tính chất ngẫu
nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất nếu được lặp lại thí
2.1.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ
thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt
DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng
khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau. Sự
khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của
các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt.
10
Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản
các đoạn DNA đã bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn. Khâu quan trọng của kỹ
thuật này là thiết kế các primer đặc trưng, được thực hiện bằng cách cắt
DNA mẫu bằng hai enzyme cắt giới hạn. DNA bị cắt thành nhiều đoạn có
kích thước khác nhau nhưng trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn cắt giống
nhau và đã xác định. Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, ta thiết kế các
đoạn oligonucletide ngắn (adapter) và gắn chúng vào hai đầu cắt. Dựa vào
trình tự adapter, thiết kế primer PCR gồm hai phần: phần có trình tự bổ sung
với adapter và phần có 1-3 nucleotide tùy ý và tiến hành phản ứng PCR [29].
Các bước thực hiện: gồm 5 bước cơ bản [29].
Bước 1: Ly trích DNA
Điều kiện tiên quyết cho phản ứng AFLP là DNA sạch và không bị gãy
Bước 2: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Sử dụng hai enzyme cắt giới hạn
Một enzyme có trình tự cắt thông thường: tạo những đoạn cắt nhỏ,
chúng sẽ được khuếch đại tốt và có phạm vi kích thước tối ưu khi phân tách
trên gel.
Một enzyme có trình tự cắt hiếm: giới hạn số lượng đoạn cắt được
khuếch đại
Bước 3: Nối đoạn DNA với các adapter (trình tự tiếp hợp)
Adapter chứa một trình tự lõi và một trình tự chuyên biệt thích hợp để
nối vào đầu đoạn cắt. Trình tự lõi của adapter chứa một đoạn DNA khoảng
chuyên biệt để nhân bản đoạn DNA này lên. Điều quan trọng là phải biết
được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng
12
giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu dùng để định danh những
giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền.
Các bước thực hiện: gồm bốn bước [8].
- Bước 1: Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu.
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với các primer đặc trưng cho các
đoạn lặp lại đơn giản.
- Bước 3: Điện di và đọc kết quả trên gel polyacrylamide. Tính toán số
liệu, xác định mức độ giống nhau và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.
- Bước 4: Xử lý số liệu bằng các phần mềm NTSYSpc, SYSTAT lập
bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại.
Ưu và nhược điểm của kỹ thuật SSR:
Ưu điểm:
- Là loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di
truyền, phân loại giống.
- Dùng để xây dựng bản đồ liên kết, phân lập gene, xác định quan hệ di
truyền, chẩn đoán cho cặp ưu thế lai.
- Đơn giản, không tốn kém, dễ thực hiện.
Nhược điểm
- Phải qua nhiều bước tiến hành.
- Cần thiết kế cặp primer chính xác.
2.1.5. mtDNA
Ở động vật ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm
trong ty thể chiếm tỷ lệ từ 1-5% DNA của tế bào. Kích thước của hệ gen ty
thể (mtDNA) ở phần lớn động vật có xương sống vào khoảng 16,8 kb, tuy
nhiên có thể sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào hoặc do mất đoạn,
hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp [18].
13
giữa hợp tử và tinh trùng. Tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa phải là
những lời giải thích thỏa đáng và thật sự thuyết phục.
DNA ty thể được sao chép từ 2 điểm khởi đầu. Sự tái bản DNA bắt đầu
từ chuỗi nặng tiếp tục cho đến hai phần ba vòng của phân tử mtDNA, chuỗi
mới sẽ thay thế chuỗi nặng ban đầu cho đến khi nó tìm được điểm khởi đầu
của chuỗi nhẹ. Phiên mã của mtDNA được khởi đầu từ 2 promoter trong
vùng D-loop. Hai sợi phiên mã theo 2 chiều ngược nhau quanh một vòng để
hình thành những phân tử RNA polycistronic. Các tRNA được tạo thành nhờ
ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng được
cuộn xoắn trong các bản phiên mã và được phân cắt. Các mRNA tự do được
polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA được biến đổi thêm CCA vào cuối
đầu 3’ [18].
2.1.6. Mức độ đa dạng di truyền
Mức độ đa dạng di truyền được đánh giá thông qua hệ số dị hợp thu
được (Ho) và giá trị thông tin đa hình (PIC) được tính theo công thức sau:
Ho = ∑x
i
/n
Trong đó: n là số cá thể trong quần thể phân tích; x
i
là 0 nếu số allele
xuất hiện ở cá thể i là 1 và x
i
là 1 nếu số allele xuất hiện nhiều hơn 1.
PIC = 1 - ∑P
i
2
Trong đó: P
i
là tần suất xuất hiện của allele thứ i.
trên đảo có thể chia thành 2 nhóm: nhóm thứ nhất bao gồm M. vaillanti từ
Fongo và Santiago và M. delalandii, nhóm thứ hai bao gồm các giống còn lại
được phân chia dựa trên đặc điểm hình thái [19].
16
Patrick Mausfeld và các cộng sự (2002) đã nghiên cứu mối quan hệ phát
sinh loài của Mabuya atlantica Schmidt, 1945 là loài đặc hữu của quần đảo
Fernando de Noronha thuộc Đại Tây Dương (Brazil). Vị trí phân loại của
thằn lằn bóng Mabuya atlantica được nghiên cứu dựa trên phân đoạn 16S và
12S rRNA. Kết quả cho thấy M. atlantica khả năng có nguồn gốc từ
Madagasy hơn là Nam Mỹ. M. atlantica có thể đại diện do việc phát tán
xuyên lục địa của loài Mabuya từ bờ biển Tây Nam Châu Phi [30].
S. Carranza và E.N. Arnold (2003) đã điều tra về nguồn gốc của sự
phân bố xuyên đại dương của loài thằn lằn bóng Mabuya bằng chỉ thị
mtDNA. Sự phát sinh loài Mabuya dựa trên hệ gen ty thể (305 bp
cytochrome b, 379 bp 12S rRNA và 388 bp 16S rRNA) được sử dụng để cho
thấy rằng chi này xâm chiếm vùng nhiệt đới châu Mỹ từ châu Phi hai lần
trong 9 triệu năm trước, một lần đến lục địa Mỹ và một đến các đảo của
Fernando de Noronha, ít nhất 3.000 km cho hai cuộc hành trình [20].
Patrick Mausfeld, Andreas Schmitz (2003) đã nghiên cứu sự đa dạng
chủng loại và hình thành loài của thằn lằn bóng châu Á Eutropis Fitzinger,
1843. Nghiên cứu sử dụng 2 phân đoạn 16S rRNA gồm 564 bp và 12S rRNA
gồm 408 bp. Kết quả cho thấy loài Trung Đông chắc chắn không thuộc
Eutropis, thay vào đó các loài Eutropis auratus (L.) và Eutropis
septemtaeniatus có thể đại diện cho các loài riêng biệt. Thêm vào đó, nghiên
cứu làm sáng tỏ hệ thống phân loại học của chi Apterygodon Edeling, giả
định cho rằng nó bắt nguồn từ Eutropis. Apterygodon không thực sự phản
ánh một đơn vị phân ngành, nó tương đồng với Dasia Gray. Dựa trên chỉ thị
phân tử mtDNA nghiên cứu đã chỉ ra được bằng chứng cho sự đơn ngành
của thằn lằn bóng châu Á Eutropis Fitzinger, chứng minh hệ thống phát sinh
loài của Eutropis multifasciata (Kuhl) và xác nhận rằng sự khác biệt của một
nigropunctata. Nghiên cứu sử dụng 1532 bp của hệ gen ty thể để phân tích
sự hình thành loài của 106 giống Mabuya Neotropical. Kết quả nghiên cứu
chỉ ra được 3 sự khác nhau lớn của các nhóm thằn lằn bóng Tây, Nam và
Đông Amazonia. Kết quả cho thấy mối quan hệ phát sinh loài của Mabuya
Neotropical được công bố bởi Whiting và cộng sự (2006) là không chính
xác. [31].
Aniruddha Data-Roy, Mewa Sigh, C. Srinivasulu, K. Praveen Karanth
(2012) đã phân tích trình tự hệ gen ty thể 16S rRNA và 12S rRNA của 44 loài
thuộc Đông Nam Á và Nam Á, Afro-Malagasy, Neotropical và Cape
Verdean. Kết quả nghiên cứu chỉ ra nguồn gốc ban đầu của Eutropis Đông
Nam Á vào Ấn Độ khoảng 5,5 đến 17 triệu năm trước khi châu Á và châu
phi nối liền nhau [21].
3.1.2. Ở Việt Nam
Năm 1979, Đào Văn Tiến thống kê thành phần và khóa định loại thằn
lằn Việt Nam đã nêu lên 4 loài Thằn lằn bóng ở nước ta là: Thằn lằn bóng Sa
Pa Mabuya chapaensis (Bourret), Thằn lằn bóng đuôi dài Mabuya
longicaudata (Hallowell), Thằn lằn bóng đốm Mabuya macularia (Blyth) và
Thằn lằn bóng hoa Mabuya multifasciata (Kuhl) [16].
Năm 1996, trong Danh lục ếch nhái, bò sát Việt Nam của Nguyễn Văn
Sáng, Hồ Thu Cúc đã thống kê ở Việt Nam hiện có 5 loài thuộc giống Mabuya
Fitzinger, 1826 bao gồm: Mabuya longicaudata, Mabuya chapaensis, Mabuya
macularia, Mabuya multifasciata, Mabuya darevski [14].
Những năm tiếp theo, có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần
loài ếch nhái, bò sát đã ghi nhận sự có mặt của các loài Thằn lằn bóng ở
nhiều nơi khác nhau, điển hình như: Lê Nguyên Ngật (1997) đã xác định
ở vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum) có loài Mabuya multifasciata. Nguyễn
Văn Sáng, Alexander L. Monastyrskii (1998) xác nhận ở Xuân Liên,
19
Thường Xuân, Thanh Hóa có 2 loài là: Mabuya multifasciata và Mabuya
macularia [14].
Các mẫu đuôi của thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820 thu
được ở miền Trung và Tây Nguyên.
Phân loại:
Thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820.
Giới: Animalia
Ngành: Chordata
Lớp: Reptilia
Bộ: Squamata
Phân bộ: Lacertilia
Họ: Scincidae
Giống: Eutropis
Loài: Eutropis multifasciata Kuhl, 1820
Bảng 2.1. Cặp primer đặc hiệu cho đoạn gen 12S rRNA của hệ gen ty
thể thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820
dNTP- 12S EMF CTTAGCCCTTAACACAGACA
dNTP-12S EMR GGTGTGTGCGCGCTCCAGAG
- Chủng vi khuẩn E.coli Top 10
- Vector tạo dòng pGEM
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
21
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng kỹ thuật gen, trung tâm ươm tạo
và chuyển giao công nghệ, Đại học Huế.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc các hãng sản xuất được
trình bày lần lượt ở bảng 2.1.
Bảng 2.2. Những thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị Hãng sản xuất
Hệ thống điện di Bio-Rad
Hệ thống gel-doc Labnet
Máy vortex Eppendorf
Máy ly tâm lạnh Eppendorf
bảo quản với Ethanol 95%.
Tiến hành tách chiết DNA tổng số dựa trên nguyên tắc màng tế bào và
màng nhân được phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh, DNA
genome giải phóng được tách sạch protein nhờ enzyme protease K và hỗn
hợp phenol, chloroform, isoamyl alcohol… Quy trình tách chiết DNA tổng
số theo Quyền Đình Thi và cộng sự [15].
Các bước tiến hành
- Cắt nhỏ 150 mg mẫu cơ, cho vào eppendorf 1,5 ml.
- Bổ sung 600 µl dung dịch phá tế bào, 1 µl proteinase K, vortex trong 30
giây. Hỗn hợp được ủ, lắc ở 55ºC từ 15-30 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng.
- Cho tiếp 300 µl 7,5M amonium acetate, vortex trong 15 giây. Hỗn hợp
được ủ trong đá 3-4 giờ.
- Tiến hành ly tâm lạnh 10 phút với 15000 vòng/phút và thu pha trên.
- Rửa lại bằng dung dịch PCI với thể tích tương đương với thể tích dịch
nổi thu được, lắc đều, để 30-60 phút sau đó ly tâm lạnh 15 phút với 15000
vòng/phút và thu pha trên.
- Dịch nổi chứa DNA được bổ sung ethanol 100% có thể tích gấp 2 lần
lượng mẫu. Hỗn hợp được đảo trộn và kết tủa DNA ở -20ºC trong nhiều giờ.
23
- Tủa sau khi ly tâm được làm khô và bổ sung 400 µl 70% ethanol, đảo
trộn rửa DNA để loại muối. Ly tâm lạnh như trên để thu tủa và làm khô.
- Giữ mẫu: hòa trong 50 µl đệm TE, trộn đều và bảo quản DNA ở -20ºC.
2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
Dựa trên nguyên tắc sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
260 nm của các base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ
quang ở bước sóng260 nm (OD
260nm
– Optical Density
260nm
) của các mẫu, và
2.2.3. Điện di agarose gel [10]
24
Dựa trên cở sở là trên khắp bề mặt của các nucleic acid đều tích điện âm
nên dưới tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp,
chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Các phân tử DNA
khác nhau về kích thước đồng thời sẽ khác nhau về điện tích sẽ di chuyển
trên gel với tốc độ khác nhau, do đó người ta có thể dễ dàng phân biệt được
chúng trên phổ điện di.
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của phân
đoạn nucleic acid cần phân tách và tùy vào mục đích nghiên cứu
Các bước tiến hành
+ Chuẩn bị gel 0,8% agarose: cân 0,8 g agarose vào 100 ml đệm
1xTBE, đun sôi bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội
khoảng 60
o
C và đổ vào khuôn điện di. Sau đó để nguội cho đến khi gel đông
(khoảng 30 phút).
+ Tra mẫu DNA vào giếng: sau khi gel đông , tra mẫu đã hòa đệm (theo
tỷ lệ 1µl mẫu:5µ đệm) vào các giếng trên bảng gel, chạy với điện trường
100V trong thời gian 30 phút đến 2,5 giờ tùy mục đích nghiên cứu.
+ Đọc kết quả: sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel với ethidium
bromide (EtBr) có nồng độ 0,5 g/ml từ 10-15 phút, rửa lại bằng nước cất và
cho vào hệ thống máy đọc gel. Chụp ảnh và phân tích kết quả.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©