ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CAO THỊ HƯỜNG

PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT
GIBERILLIC TRONG RAU XANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Cao Thị Hường

1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học 4
1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng 5
1.2.3. Độc tính 7
1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng 7
1.3. Phƣơng pháp xác định axit giberellic 8
1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV-VIS 8
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký hiệu năng cao 8
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen 9
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 11
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 11
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 11
2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 11
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 11
2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết 11
2.2.2. Dụng cụ 12
2.2.3. Thiết bị 12
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 12
2.4. Điều kiện phân tích 14
2.4.1. Tiến trình phân tích 14 2.4.2. Tính toán 14
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15
3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu xác định GA3 theo phổ UV-VIS 15
3.1.1. Phổ hấp phụ 15
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng các yếu tố đến phép đo 16
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của thể tích etanol 16
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HCl 17
3.1.2.3. Ảnh hƣởng của thể tích nƣớc 18
3.1.3. Khảo sát trên điều kiện tối ƣu theo mặt mục tiêu 19

Bảng 3.11 : Hàm lƣợng hoạt chất GA3 trong các mẫu điều tra
Bảng 3.12 : Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn
Bảng 3.13 : Hàm lƣợng GA3 trong các mẫu phân bón
Bảng 3.14 : Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau cải theo thời gian
Bảng 3.15: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau diếp cá theo thời gian
Bảng 3.16: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau muống theo thời gian DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của GA3
Hình 1.2 : GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL
Hình 3.1 : Phổ của GA3
Hình 3.2 : Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng GA3 trong khoảng tuyến tính
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi
Hinh 3.4 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau cải
Hình 3.5 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau diếp cá
Hình 3.6 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau muống
Hình 3.7 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau cải
Hình 3.8 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau diếp cá
Hình 3.9 : Các đồ thì thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau muống


1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề đáng báo động với ngƣời
dân và các cấp quản lý. Nhiều vụ việc nhƣ sử dụng những hoá chất cấm trong nuôi
trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, sản phẩm kém chất lƣợng lƣu hành trên
thị trƣờng đang gây ảnh hƣởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng, các vụ ngộ độc
thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật (BVTV),
càng làm bùng lên sự lo âu của ngƣời tiêu dùng.
Một trong nhiều nguyên nhân gây ra thực trạng ô nhiễm hóa chất BVTV trong
nông sản là chi phí phân tích cao, đầu tƣ thiết bị phân tích lớn, quá trình phân tích
sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại, quy trình phân tích phức tạp…Vì vậy việc
phát triển các phƣơng pháp phân tích theo hƣớng thân thiện với môi trƣờng, chi phí
thấp, cách làm đơn giản là phƣơng án cần chú trọng.
Trƣớc tình trạng chạy theo lợi nhuận lạm dụng thuốc kích thích sinh trƣởng
trên rau tại các vùng sản suất rau ở Hà Nội, Hà Tây nên việc điều tra thống kê, tiến
hành khảo nghiệm loại thuốc kích thích sinh trƣởng đang sử dụng là hết sức cần
thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, để làm cơ sở cho
công tác quản lý.
Trên cơ sở điều tra luận văn sẽ tập trung vào loại thuốc KTST dùng phổ biến
nhất. Phƣơng pháp phân tích đƣợc xây dựng theo hƣớng hóa học xanh sử dụng ít
dung môi hữu cơ, dùng các chất vô cơ không độc hại, quy trình phân tích đơn giản.


đƣờng kính thân cây.
- Điều khiển quá trình ra hoa, đậu quả chính vụ và trái vụ.
- Điều khiển quá trình ra rễ cho cây, cành giâm cành chiết.
- Điều khiển quá trình bảo quản hoa, quả trên cây và trong kho.
- Điều khiển quá trình già của các bộ phận của cây.
3

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của từng chất, ngƣời ta có thể phun trực tiếp lên
từng bộ phận của cây trồng các chất riêng biệt ở các nồng độ khác nhau.
Hiện nay có ba con đƣờng thu nhận các chất điều hòa sinh trƣởng: Chiết xuất
từ thực vật, bằng con đƣờng lên men vi sinh vật, và bằng con đƣờng tổng hợp hóa
học.
+ Con đƣờng chiết xuất từ thực vật: Các chất điều hòa sinh trƣởng đều có
mặt trong các bộ phận của cây trồng, nhƣng chúng ở nồng độ rất thấp, do vậy bằng
con đƣờng chiết xuất thì thực vật thì hiệu suất thu hồi thấp, dẫn tới giá thành cao. Vì
vậy, trong thực tế nếu chất nào có thể thu nhận đƣợc bằng con đƣờng hóa học hoặc
vi sinh vật thì không bao giờ thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất từ thực vật.
+ Thu nhận bằng con đƣờng lên men vi sinh vật: Chất điều hòa sinh trƣởng
nổi tiếng và mang lại nhiều ứng dụng nhất là gibberellin đã đƣợc thu nhận bằng con
đƣờng này. Bằng những kỹ thuật lên men, các nhà khoa học đã nuôi cấy nấm Fusa-
rium moniliforme Trong quá trình phát triển nấm Fusarium moniliforme đã tổng
hợp đƣợc chất kích thích sinh trƣởng gibberellin và tiết vào môi trƣờng lên men.
Bằng kỹ thuật tách chiết, gibberellin đã đƣợc tách khỏi nuôi cấy và kết tinh dƣới
dạng tinh thể màu trắng. Ở Việt Nam, gibberellin cũng đã đƣợc thu nhận đƣợc bằng
con đƣờng lên men vi sinh vật đang ứng dụng rộng ở Việt Nam.
+ Thu nhận bằng con đƣờng hóa học: Có nhiều chất điều hòa sinh trƣởng
đƣợc sản xuất bằng đƣờng hóa học nhƣ nhóm chất auxin, etilen… Đây là con
đƣờng sản xuất kinh tế nhất. Hiện nay ở nƣớc ta thu nhận các chất nhƣ auxin, ety-
len bằng con đƣờng hóa học đang đƣợc tiến hành phổ biến ở một số Viện và các
Trung tâm hóa học.

1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học
Axit giberelic (GA3) là chất có nhiều ứng dụng nhất trong nhóm Giberellin.
Hoạt chất đƣợc các nhà hóa học Nhật Bản phân lập và xác định cấu trúc từ những
năm 30 của thế kỷ XX. Đây là chất có cấu trúc phân tử phức tạp, gồm các nhị vòng
và 8 trung tâm không gian. Mỗi cấu trúc có hoạt tính sinh học riêng và tác động lên
5

cây trồng theo những cách khác nhau. Tùy vào mục đích sử dụng, ngƣời ta có thể
tạo ra những đồng phân có cấu trúc phù hợp đƣợc xác định. [14]

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của GA3
GA3 có khối lƣợng mol 346,4 đvc, thể kết tinh rắn nhiệt độ nóng chảy 223 –
225
0
C đƣợc công ty ICI Plant Protection ( bây giờ là tập đoàn Syngenta AG) lần
đầu tiên đƣa vào nông nghiệp ở dạng sản phẩm thƣơng mại.
Một trong những quá trình có liên quan đến cơ chế tác động của giberellin
đƣợc nghiên cứu khá kỹ, là hoạt động của enzyme thủy phân trong các hạt họ lúa
nảy mầm. Giberellin gây nên sự giải ức chế gen màchịu trách nhiệm tổng hợp các
enzyme này mà trong hạt đang ngủ nghỉ chúng hoàn toàn bị trấn áp bằng các pro-
tein histon. Giberellin đóng vai trò nhƣ là chất cảm ứng mở gen để hệ thống tổng
hợp protêin enzyme thủy phân hoạt động. Ngoài vai trò cảm ứng hình thành enzyme
thì gibberellin còn có vai trò kích thích sự giải phóng các enzyme thủy phân vào nội
nhũ xúc tiến quá trình thủy phân các polime thành các monome kích thích sự nảy
mầm của các loại hạt
Axit giberellic là chất ổn định, dễ bắt cháy và không tƣơng thích với các axit
và các chất ôxi hóa mạnh
1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng
kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lá. Hiệu quả này có đƣợc là do GA3 kích thích

Hình 1.2. GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL
1.2.3. Độc tính GA3
Axit giberillic có thể có tác động nhƣ là một chất gây kích thích dị ứng đối
với mắt. Liều gây tử vong đối với 50% mẫu chuột cống thử nghiệm bằng đƣờng
miệng là 6,300 mg/kg. Các chỉ dẫn về an toàn sức khỏe là S26: Nếu tiếp xúc với
mắt, cần rửa mắt ngay lập tức bằng nhiều nƣớc và tìm kiếm hỗ trợ y tế, S36: Sử
dụng quần áo bảo hộ lao động thích hợp.[5]
1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng [11]
Về mức dƣ lƣơng cho phép (MRL – Maximum Residue Level) của Gibberel-
lin trên rau là 0,001 ppm.[5]
Năm 1995, Cục Bảo vệ Môi trƣờng Hoa Kỳ (nơi cấp phép cho các hóa chất
đƣợc sử dụng trong nông nghiệp) đã xếp GA3 nằm ở nhóm chất độc nhóm II. EPA
cho phép sử dụng GA3 ở Hoa Kỳ mà chƣa có cảnh báo cụ thể về ảnh hƣởng của nó
đối với môi trƣờng cũng nhƣ vật nuôi và sinh vật hoang dã (theo Environmental
Protection Agency, 1995). Tổ chức WHO và một số nƣớc khác cũng xếp GA3 vào
nhóm độc II. Tại New zealand cũng không áp dụng mức dƣ lƣợng tối đa cho phép
(MRL) đối với GA3 mà chỉ cần điều kiện dùng <200 ha/năm. Tại Đài Loan, MRL
của GA3 đối với rau là 5 mg/kg, Nhật Bản là 0,2mg/kg. Có thể nói GA3 tƣơng đối
an toàn cho ngƣời sử dụng rau quả.
8

Ngày nay trên thị trƣờng GA3 đƣợc sản xuất bởi các hãng khác nhau mang
các tên thƣơng phẩm khác nhau, chẳng hạn nhƣ 920 (BSI), Berelex (ICI), Gib-Tabs
(Elanco), Gib-sol (Elanco), pro-Gibb (Abbott), Pro-Gibb Plus (Abbott), Activol
1.3. Các phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng GA3
1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV – VIS
Phƣơng pháp phổ quang học đƣợc đề xuất bởi Holbrook et al (1961), đây là
một trong những phƣơng pháp đơn giản nhất và đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định
GA3 trong nghiên cứu sự lên men. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện bằng cách cho
thêm HCl vào mẫu và đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 254nm trong 75 phút.


250mm x 46mm. Pha động chứa 35% methanol và 65% nƣớc. Điều chỉnh pH của
pha động bằng axit H
3
PO
4
sao cho pha động luôn có pH 3.0. Tốc độ dòng 1ml/phút.
Xử lý mẫu: Mẫu đƣợc lọc qua màng lọc có kính thƣớc lỗ 42 và đƣợc điều
chỉnh pH bằng HCl 0.1M để pH 3.0. Lấy 3,0ml mẫu trên cho ống thủy tinh 10ml.
Thêm 4ml CH
3
COOC
2
H
5
vào ống thủy tinh chứa mẫu. Hỗn hợp này đƣợc lắc trong
4 phút để GA3 đƣợc chiết vào trong CH
3
COOC
2
H
5
. Tiến hành chiết, ta thu đƣợc
dịch chiết, tiếp đến dịch chiết này cho vào một ống thủy tinh khác có chứa NaHSO
4

để loại nƣớc. Tiếp đến dung dịch thu đƣợc chuyển vào một ống thủy tinh khác và
đƣợc làm bay hơi trong chân không để loại bỏ CH
3
COOC

o
C. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, mao quản đƣợc rửa bằng dung
dịch NaOH 0,1M trong khoảng 15 phút. Sau đó mao quản đƣợc rửa tiếp bằng dung
10

dịch đệm của MECK trong khoảng 15 phút. Mẫu và dung dịch chuẩn đƣợc bơm vào
ở áp suất 0,5 psi trong 4 giây. Thế trong suốt quá trình tách là +30kV. Sử dụng de-
tector UV ở bƣớc sóng 214nm. Mỗi thí nghiệm chạy 3 lần.[16]
Nhu vậy, ta thấy rằng trong các phƣơng pháp xác định Giberillic thì phƣơng
pháp trắc quang UV-VIS đơn giản, sử dụng ít hóa chất, thiết bị sử dụng ít và chí phí
thấp. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp này để xác định dƣ lƣợng
axit gibberillic trong rau xanh.

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết
Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết
phân tích (PA) gồm:
- Chất chuẩn Gibberellic axit 98%
12

- Etanol tuyệt đối
- HCl đặc 37%
- Natrihidrophotphat (Na
2
HPO
4
)
- Kalidihidrophotphat (KH
2
PO
4
)
- Etylaxetat (CH
3
COOC
2
H
5
)
* Dung dịch chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml
Cân khoảng 0.01 gam chất chuẩn GA3 chính xác tới 10
-5

13

* Phương pháp khảo nghiệm:
Tiến hành thí nghiệm ở diện tích hẹp khoảng 1m
2
. Khảo nghiệm thuốc KTST
có nồng độ nhƣ bảng 2.1
Các mức nồng độ của thuốc khảo nghiệm đƣợc khảo sát trên cả 3 loại rau:
rau cải, rau diếp cá và rau muống.
Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST
STT
Tên thuốc khảo nghiệm
Liều lƣợng
1
Tăng phọt 920
10ml/mg/m
2
2ml/mg/m
2
1ml/mg/m
2

2
Viên sủi GA3
10ml/mg/m
2

1ml/mg/m
2


2.4.1. Tiến trình phân tích
- Xây dựng đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa độ hấp thu quang và
nồng độ chất chuẩn của hợp chất Gibberellic tại các mức nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 20,
30 µg/ml.
- Xác định hàm lƣợng Gibberillic trong phân bón.
- Tiến hành phun lên rau (3 loại rau: rau cải, rau muống và rau diếp cá) các
loại phân bón với các liều lƣợng nhƣ ở bảng 2.1.
- Tiến hành chiết tách Gibberillic trong rau xanh.
- Sau khi chiết tách GA3 ra khỏi rau, mang đi đo độ hấp thụ quang và xác
định nồng độ dựa vào đƣờng chuẩn.
2.4.2. Tính toán :
Xác định dƣ lƣợng GA3 trong rau dựa vào đƣờng chuẩn. Dƣ lƣợng GA3 có
trong mẫu đƣợc xác định theo công thức sau:

m
PVCm
kgmgR

)/( 

Trong đó
- Cm: là nồng độ mẫu đƣa vào (µg/ml)
- V: Thể tích định mức cuối cùng trƣớc khi đem đo, ml
- m: khối lƣợng mẫu thử (g)
- P: Độ tinh khiết của mẫu, %
2ml. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là
mẫu trắng chứa HCl và etanol tuyệt đối, đƣợc bảng kết quả 3.1.
Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích etanol
Thể tích etanol (ml)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,123
0,12
0,151
0,149
0,137

Để xác định ảnh hƣởng của thể tích etanol đến độ hấp thụ quang, chúng tôi
tiến hành so sánh sai khác các kết quả thí nghiệm khi thay đổi các mức thể tích eta-
nol bằng các so sánh phƣơng sai do sự thay đổi mức nghiên cứu gây nên với
phƣơng sai chung σ
2
của thí nghiệm xem chúng có khác nhau đáng tin cậy hay
không. Nếu sự khác nhau không đáng tin cậy thì có thẻ kết luận thể tích etanol sẽ
ảnh hƣởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm và ngƣợc lại. Sử dụng phầm mềm
Minitab 14 ta thu đƣợc kết quả sau:
Nguồn
DF
SS
MS

phƣơng sai là có nghĩa tức là các giá trị trung bình trong những điều kiện khác nhau
là khác nhau. Nhƣ vậy là thể tích etanol có ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang. Tại
V
etanol
= 1ml thì A là lớn nhất (A = 0,155), độ hấp thụ quang ổn định. Do đó từ các
thí nghiệm sau độ hấp thụ quang A đo với V
etanol
= 1ml.
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HCl
Chuẩn bị dung dịch gốc nồng độ GA3 5µg/ml, giữ thể tích etanol là 1ml, thể
tích nƣớc là 0ml, thay đổi nồng độ HCl thêm vào với các mức 3, 3.25, 3.5, 3.75,
4M, đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là mẫu
trắng chứa nền mẫu là etanol và HCl. Mỗi mức nồng độ làm lặp lại 3 lần. Kết quả
thu đƣợc bảng 3.2:
Bảng 3.2. Đô hấp thụ quang của dung dịch GA3 khi thay đổi nồng độ HCl
Nồng độ HCl (M)
3,0
3,25
3,5
3,75
4,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,102
0,116
0,128
0,155
0,135

Để xác định sự ảnh hƣởng của nồng độ HCl đến độ hấp thụ quang, chúng tôi


S=0,001390
R-Sq=99,58%
R-Sq(adj)=99,42%
Theo nhƣ tính toán trên, ta thu đƣợc P
value
= 0,000<0,05. Vậy có sự sai khác
có nghĩa giữa hai phƣơng sai, chứng tỏ nồng độ của axit HCl có ảnh hƣởng đến độ
hấp thụ quang. Dựa vào bảng kết quả 3.2 ta chọn C
HCl
= 3,75M để đo.
3.1.2.3. Ảnh hƣởng của nƣớc
Chuẩn bị dung dịch gốc nồng độ GA3 5µg/l, giữ nồng độ HCl là 3.75M, thể
tích etanol là 1ml, thay đổi thể tích nƣớc thêm vào với các mức 0, 0.5, 1, 1.5, 2ml.
Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là mẫu
trắng với nền mẫu chứa etanol tuyệt đối và HCl, đƣợc bảng kết quả 3.3.
Bảng 3.3: Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích nƣớc
Thể tích nƣớc (ml)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,151
0,120
0,117
0,104
0,096