ii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ
Sinh Học trường Đại học Bách Khoa – Đại Quốc Gia Tp HCM đã truyền đạt những
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Xin cảm ơn cha mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi có thể học tập tốt
và an tâm hoàn thành tốt luận văn.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã tạo
điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thanh Bình đã tận tình
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chò thuộc phòng Công nghệ sinh
học – Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã động viên tinh thần và nhiệt tình
giúp đỡ tạo điều kiên để tôi thực hiện tốt luận văn.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH đã cùng tôi học tập trao đổi kiến thức giúp
tôi học tập tốt. iii
TÓM TẮT
Ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo giống cây trồng mới đã được
các nhà khoa học trên thế giới thực hiện rất thành công, một trong những ứng dụng
này là việc nuôi cấy-dung hợp tế bào trần tạo được nhiều giống cây trồng mới có
năng suất và chất lượng cao góp phần đa dạng di truyền nguồn gene cây trồng trên
toàn thế giới.
Các ứng dụng này trên các giống loài cây có múi khác nhau cũng được các
nhà khoa học trên thế giới thành công rất nhiều, do đó việc ứng dụng này để cải
thiện các giống cam quýt của Việt Nam là cần thiết đặc biệt là các giống bưởi, qt
ngon của Việt Nam còn nhiều đặc tính cần cải thiện như nhiều hạt và mẫn cảm với
2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi 5
2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi 7
2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật 11
2.2.1 Cellulose 12
2.2.2 Hemicellulose 12
2.2.3 Pectin 12
2.2.4 Lignin 12
2.3 Tế bào trần 13
2.3.1 Đònh nghóa 13
2.3.2 Đặc điểm của tế bào trần 13
v
2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần 14
2.4 Phân lập tế bào trần 14
2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần 14
2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần
15
2.4.3 Enzyme dùng để tách tế bào trần 18
2.4.4 Phương pháp chung phân lập tế bào trần 21
2.5 Cấy tế bào trần 24
2.5.1 Môi trường nuôi cấy tế bào trần 24
2.5.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào trần 25
2.6 Sơ lược một số thành tựu của kỹ thuật tế bào trần trên cây có múi 26
2.7 Giới thiệu một quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào trần cây tắc [10] 29
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu 31
3.2 Vật liệu và dụng cụ 31
3.2.1 Vật liệu 31
3.2.2 Dụng cụ 31
3.2.3 Hóa chất và thiết bò 32
BAP : 6-benzynlaminopurine
MES : 2(N-morpholino) ethanol sulfonic acid
MS : (Murashige và Skoog, 1962)
MT : (Murashige và Tucker, 1969)
NAA : 1-naphthalene acetic acid
TBT : Tế bào trần
VLG : Vàng lá Greening
CCM : Cây có múi
RCC : Rầy chổng cánh
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Một số loại cây có múi 4
Bảng 2.1 Các giống và loài cây có múi được tái sinh trong phòng thí nghiệm. 28
Bảng 3.1 Dung dòch A (DD Enzyme) 34
Bảng 3.2 Dung dòch B (DD rửa) 34
Bảng 3.3 Dung dòch C (ly tâm thu nhận TBT) 34
Bảng 3.4 Dung dòch D (ly tâm thu nhận TBT) 35
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 1 38
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 2 39
Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 3 40
Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 4 41
Bảng 4.1: Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô
lá cây tắc (tế bào x 10
7
/g) 42
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thòt lá cây tắc (tế bào
x 10
7
/g) 43
tiếng như Bưởi Diễn, Cam Canh Hà Nội, Cam Sành Hà Giang, cam Xã Đoài
Riêng ĐBSCL, cây có múi tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vónh Long, Đồng
Tháp và Cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh,
quýt Tiều, quýt Đường, cam Mật, cam Sành, v.v. Tuy đem lại nguồn kinh tế cao
nhưng cây có múi nhiễm không ít bệnh nguy hiểm và ngành trồng cây có múi
vẫn đang đứng trước những thách thức rất lớn.
Bệnh Greening là một trong những bệnh hại quan trọng trên cây có múi.
Bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Nam Phi vào năm 1947 và hiện nay bệnh này
đã và đang lan rộng trên 50 quốc gia, gây thiệt hại cho ngành sản xuất cây ăn
quả có múi trên toàn thế giới. (Bar Joseph at al., 1989). Ở Việt Nam, bệnh được
ghi nhận từ năm 1960 và hiện nay nhiều vườn cây đã bò chặt bỏ hoàn toàn chỉ
sau vài năm trồng do người dân chiết hoặc ghép từ cây đã bò nhiễm bệnh.
Kết quả điều tra đã ghi nhận hầu hết các vườn trồng cây có múi ở các tỉnh
phía Bắc - Việt Nam như Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An đều có tỷ lệ cây
nhiễm bệnh greening cao lên tới 60-65%. Ở đồng bằng sông Cửu Long một số
Chương 1: Mở đầu
2
diện tích trồng cam Sành có năng suất thấp, bò bệnh đã bò người nông dân phá
bỏ để trồng lúa hoặc thay thế bằng cây trồng khác.(Hà Minh Trung, 2008). Bệnh
lây lan nhanh trên đồng ruộng thông qua nhân giống vô tính và môi giới truyền
bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri).
Để hạn chế bệnh lây lan trên đồng ruộng nhiều giải pháp đã được đề xuất
như trồng mới bằng cây giống sạch bệnh, phòng trừ tổng hợp vector truyền bệnh
VLG trong đó chú ý biện pháp quản lý cây giống sạch bệnh trước khi trồng, thời
điểm trồng và biện pháp trồng xen cây giống sạch bệnh trong vườn ổi. Nghiên
cứu giống kháng hoặc chống chòu bệnh VLG cũng được các nhà nghiên cứu trên
thế giới quan tâm đầu tư nghiên cứu chọn tạo giống kháng/chống chòu đối với
bệnh này. Trong một báo cáo gần đây, Toru Iwanami, 2010 báo cáo xác đònh
được giống qt Unzoki (C. keraji hort. ex Tanaka var. unzoki hort. ex Tanaka)
có khả năng chống chòu tốt bệnh VLG, cây qt này sau hai năm nhiễm bệnh
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
4
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi
2.1.1 Phân loại
Cây có múi (Citrus) có vò trí phân loại là:
Ngành Angiospermae (hạt kín)
Lớp dicotyledones (hai lá mầm)
Bộ Rutales (cam)
Họ Rutaceae (cam)
Bảng 2.1 Một số loại cây có múi
Tên Tiếng Anh
Tên La Tinh
Tên Việt Nam
Calamondin
Citrofortunella mitis
Tắc, quất
Sour orange
Citrus aurantium
Cam chua
Mandarin
Citrus reticulata
Quýt
Orange
Citrus sinensis
Cam
Lemon
Citrus limon
Chanh
Grapefruit
1929 bệnh đã xuất hiện rộng rãi. Bệnh VLG đã lan rộng trên 50 quốc gia ảnh hưởng
nghiêm trọng đến các nước thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á. Hiện chưa có báo cáo
chính thức về thiệt hại do bệnh gây ra tuy nhiên với thông số điển hình như ở Thái Lan
95% CCM thuộc khu vực phía Bắc và Đông nhiễm bệnh, ở Philippines mức độ nhiễm
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
6
bệnh lên đến 7 triệu CCM và nhìn chung hơn 60 triệu CCM đã bò tàn phá ở 2 châu lục
này.
Tại Việt Nam dòch bệnh VLG đã tàn phá nặng nề các vườn CCM từ Nam chí
Bắc vào những thập niên 1970-1980, tuy đã xác đònh được nguyên nhân gây bệnh
1975 nhưng hướng giải quyết còn nhiểu khó khăn, thế nên ước tính mỗi năm chỉ
riêng ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long thiệt hại khoảng 180 tỷ đồng.
Hiện cả trong, ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu về bệnh và xác đònh bệnh lây
truyền qua 2 con đường là mắt ghép và côn trùng truyền bệnh. Theo báo cáo Gar-
nier và cộng tác viên tác nhân gây bệnh VLG là vi khuẩn Gram âm hiện diện trong
mô libe. Đặc tính của dòng khuẩn này được xác đònh thông qua việc đònh vò chuỗi
gene 16S ribosome DNA và protein trong ribosome.
Có 2 loài vi khuẩn gây bệnh VLG trên CCM: 1.dòng khuẩn gây hại ở Châu Phi
Candidatus Liberibacter africanus do rầy chổng cánh Trioza erytreae là môi giới truyền
bệnh, dòng vi khuẩn này mẫn cảm với khí hậu nóng, thể hiện triệu chứng bệnh ở nhiệt
độ khoảng 22-24
0
C . 2.dòng khuẩn Châu Á (có Việt Nam) Candidatus Liberibacter asia-
ticus do rầy chổng cánh Diaphorina citri là môi giới truyền bệnh ( Aubert và Quili-
ci,1984; Bové và cộng sự, 1980). Dòng khuẩn này được xếp vào nhóm chống chòu với
khí hậu nóng nhiệt độ thích hợp thể hiện triệu chứng bệnh từ 27-32
0
C.
Rầy chổng cánh thuộc loại côn trùng chích hút, biến thái không hoàn toàn.RCC có
kích thước 3,2 – 3,5 mm, màu nâu xám, có 9-10 đốt râu màu nâu đỏ, đầu có 2
C , chu kỳ
sáng 14 giờ hoặc 7 giờ, trên giống C.mitis cv. Blanco [31].
Duran-Vila và công sự (1989) sử dụng môi trường MS+ 3% sucrose và NAA,
BAP. Trong nuôi cấy đoạn thân của 4 giống Citrus : C.sinensis, C.aurantifolia,
C.medica, C.jambhiri. Với pH 5,7 ở nhiệt độ 25-27
0
C, ẩm độ 60% [6].
Dias và Rogers (1992) đã nghiên cứu về loại mảnh cấy và đònh hướng trong
việc tái sinh thân và rễ của giống Swingle citrusmelo (C.paradisi x Poncitrus trifo-
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
8
liata) mảnh cấy được lấy từ hạt nẩy mầm được gieo trong môi trường shocker
(pulsed) với 10, 6, 2 hoặc 0 mg/l BAP trong 48 giờ và chuyển sang môi trường MT
có bổ sung thêm 2g/l gelrite [27].
Môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy mô cây có múi là MS (Murashige-
và Skoog,1962), MT (Murashigevà Tucker) và Gamborg (B5). Parthasarathy và
Nagaraju (1996) đã thu được chồi từ phôi nẩy mầm của 7 giống cây có múi : Citrus
reticulata, C. madurensis, C. reshni, C. volkameriama, C. taiwanica, C. sinensis cvs.
và C. limon trên môi trường MS và B5 được bổ sung thêm BAP. Hầu hết các giống
đều phát triển tốt trên môi trường MS chỉ trừ C. reshni [27].
Kordan (1959) lần đầu tiên trình bày về tiềm năng phát triển của nuôi cấy mô có
thể thu được mô sẹo từ con tép của quả chanh. Ông ta sử dụng môi trường lỏng chỉ
chứa đường và khoáng chất [20].
Nuôi cấy invitro cây có múi
Ranga Swamy (1961) nuôi cấy phôi và phôi tâm của C. microcarpa trong môi
trường Ranga Swamy II (1961) bổ sung 1mg/l IAA tạo được mô sẹo và phôi. Khi
cấy chuyền sang môi trường có bổ sung GA
3
(1mg/l) và kinetin (0,01mg/l), phôi sẽ
tăng trưởng tạo chồi con [28].
khoáng đa lượng Knop với thành phần khoáng vi lượng MS có bổ sung thêm 5 mg/l
BA, 3-4% sucrose và chiếu sáng ở điều kiện 2200 lux. Số chồi ra trung bình là 3,1
công trình không có nghi nhận nào về tác động của kinetin, 2iP, nồng độ agar, sự
bổ sung nước cam hay nguồn nitrogen đến việc tạo chồi. Chồi tái sinh sau đó được
xử lý ra rễ trong môi trường MT có bổ sung 1 mg/l NAA và 0,5% agar [18].
Moore (1986) cấy lóng thân của C.aurantium trong môi trường MT có bổ sung
5 mg/l BAP và 1 mg/l NAA tạo đïc chồi bất đònh, các chồi này sau đó được xử lí
cho ra rễ trong môi trường có bổ sung 1 mg/l NAA [23].
Naima Beloualy (1990) cấy phôi của 3 loài: Citrus aurantium, Poncitrus trifo-
liata và Carrizo citrange (C. sinensis x Poncitrus trifoliata) trong môi trường MT có
bổ sung 2,4 D (2 mg/l), BAP (5 mg/l), sucrose (50 g/l). Phôi tạo mô sẹo sau 2 tuần
nuôi cấy trong tối. Cấy chuyền mô sẹo vào môi trường MT có NAA (1 mg/l) và BA
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
10
(5 mg/l) trên mô sẹo sẽ xuất hiện phôi hình cầu và chồi bất đònh nhiều nhất trên 2
loài Poncitrus trifoliata và Carrizo citrange, trong khi mô sẹo của Citrus aurantium
không phản ứng với môi trường trên mà lại tạo chồi và phôi mạnh nhất trên môi
trường có NAA (1 mg/l) và BA (10 mg/l). Chồi của 3 loại được tạo rễ trong môi
trường MT có bổ sung NAA (1 mg/l) và phôi hình cầu sẽ nẩy mầm và tạo thân rễ
với môi trường MT có bổ sung GA
3
(1 mg/l) [25].
Ling (1990), Kunitake (1991) đã tạo mô sẹo có phôi bằng cách nuôi cấy noãn
chưa phát triển của qt Satsuma. Trong khi Rangan (1993) sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô sẹo có phôi (embryogenesis callus) ở C. sinensis [21].
Eugenio Pérez-Molphe-Balch (1997) tạo chồi bằng cách nuôi cấy lóng thân
cây con gieo trong ống nghiệm của 2 loài Mexican Lime (C.auranfolia) và Manda-
rin (C.reticulata) trên môi trường MS có bổ sung 33,3 µmg BA và 5,4 µM NAA, vi-
tamin B
5
lượng hạt/quả thấp có nguồn gốc từ giống Encore, W. Murcott và Kinnow [29].
2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật [38]
Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật [38]
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
12
Thành phần chính của vách tế bào là các polysaccharide có cấu trúc phức
tạp được tạo nên từ các monosaccharide đơn giản. Có 11 loại monosaccharide phổ
biến cấu tạo nên các loại polysaccharide, trong đó có glucose và galactose. Có
nhiều thành phần khác nhau cấu tạo nên vách tế bào như cellulose, hemicellulose,
pectin, lignin …[39].
2.2.1 Cellulose
Cellulose là thành phần có tỉ lệ cao nhất trong thành tế bào thực vật [17].
Một loại polysaccharide được tạo nên bởi đơn phân là các phân tử đường glucose
bởi liên kết β-1,4-D-glucoside.
2.2.2 Hemicellulose
Hemicellulose là nhóm các polysaccharide liên kết với nhau theo dạng nhánh.
Được đặc trưng bởi sự hòa tan trong kiềm mạnh. Hai loại hemicellulose phổ biến
trong tế bào thực vật là xyloglucan và glucuronoxylan. Ngoài ra còn có các loại
hemicellulose khác ít phổ biến hơn được tìm thấy trong vách thứ cấp (secondary
wall) là glucomannan, galactoglucomannan, và galactomannan [39].
2.2.3 Pectin
Là nhóm có chứa đa dạng các polysaccharide và đặc biệt rất giàu acid pectic.
Pectin có nhiều trong vách chính (primary wall) và phiến giữa hai vách tế bào liền
nhau (middle lamella). Các loại pectin bao gồm: galacturunan (homogalacturonan,
substituted galacturonans, rhamnogalacturonan-II) và rhamnogalacturonan–I[17].
2.2.4 Lignin
Khi tạo ra được tế bào trần, các nhà khoa học cho thấy khả năng vô cùng lớn
của nó trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất. Những ứng dụng của tế bào trần
được liệt kê như sau:
Các nhà khoa học sử dụng tế bào trần như một đối tượng sinh học trong công
tác nhân giống. Chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần cùng loài để
tiến hành lai giống. Khi đó vật chất di truyền của các cá thể trong cùng một loài có
thể trao đổi với nhau. Kết quả là chúng ta thu nhận được tính trạng mới trong mỗi
loài. Phương pháp này giống như hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn. Ngoài ra các nhà
khoa học còn dựa vào khả năng tiếp nhận không chọn lọc các vật chất di truyền
của tế bào trần để tiến hành lai khác loài và từ đó tạo ra tính đa dạng sinh học.
Các nhà khoa học còn sử dụng tế bào trần như cơ thể nhận các vật liệu di
truyền từ các giới sinh vật khác nhờ đặc tính tiếp nhận không chọn lọc của tế bào
trần. Đây là bước đột phá của rất quan trọng trong công nghệ sinh học. Từ đó các
nhà khoa học sẽ có khả năng tạo ra những giống mới không chỉ có đặc tính của một
loài, khác loài mà còn khác cả giới sinh vật. Việc tái sinh tế bào trần thành một
cây hoàn chỉnh đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất.
Các nhà khoa học cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần để sản
xuất các sản phẩm thứ cấp giống như phương pháp nuôi cấy tế bào đơn.
2.4 Phân lập tế bào trần
2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần
Mô và cơ quan dùng tách tế bào trần rất đa dạng như là: lá, chồi ngọn, bao lá
mầm, cánh hoa, quả, rễ, mắt rễ, lông hút, tế bào mẹ hạt phấn, ống phấn, hạt phấn.
Mặt khác, mô thòt lá là nguồn nguyên liệu chung nhất của việc tác phần lớn tế bào
trần bởi vì dễ dàng có được [27]. Mẫu lá lấy từ cây gieo bằng hạt trong phòng thí
Chương 2: Tổng quan và tài liệu
15
nghiệm thường được sử dụng để tách tế bào trần vì không cần qua giai đoạn khử
trùng.
Tế bào trần còn được tách từ mô sẹo invitro và huyền phù tế bào. Mô sẹo và
huyền phù tế bào là nguồn tách tế bào trần được chuộng hơn bởi vì tốc độ phát tri-
của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và
ngoại sinh. Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mô sẹo gồm IAA
(10
-10
–10
-5
M) và NAA (10
-10
–10
-5
M). Một vài mô không thể tạo được mô sẹo khi
chỉ có tác dụng của auxin và đòi hỏi cần có cả sự có mặt của cytokinin.
Để duy trì mô sẹo đòi hỏi phải có sự hiện diện của các amino acid khác nhau
trong môi trường nuôi cấy. Các amino acid được sử dụng trong môi trường nuôi cấy
là glycine, arginine, hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolase.
Mô sẹo thường được tăng trưởng trên môi trường đặc, còn trong môi trường
lỏng thì đôi khi cũng được sử dụng. Agar là chất làm đặc môi trường thông dụng
nhất và được sử dụng với nồng độ 6–10 g/l. Agar sẽ lỏng ra ở 100
0
C và đặc lại ở
45
0
C. Đặc biệt agar không tác dụng với các thành phần của môi trường dinh dưỡng
và không bò phân hủy bởi enzyme.
- Cấy chuyền
Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai
đoạn. Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm, cạn kiệt nguồn dinh
dưỡng và môi trường bò khô nước. Mẫu được nuôi ở 25
0
C thì nên được cấy chuyền
Copyright: Tài liệu đại học ©