L
LL
Lời
ii
i c
c c
cảm
mm
m
ơn
nn
n • Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với
PGS.TS Lê Văn Phủng, thầy hướng dẫn trực tiếp tôi từ những ngày ñầu của
chuyên ngành vi sinh, người có ảnh hưởng lớn nhất ñối với tôi về sự cẩn thận, ý
thức trách nhiệm trong công việc.
• Tôi xin chân thành cảm ơn :
- Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau ñại học trường Đại học Y Hà Nội,
- Các thầy cô, cán bộ công nhân viên Bộ môn Vi sinh ñã truyền ñạt kiến thức và
tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
• Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành tới:
- PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Linh, phó Viện trưởng Viện Kiểm ñịnh Quốc gia
Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Ban Lãnh ñạo, Phòng Kiểm ñịnh chất lượng Công ty Vắc xin và Sinh Phẩm
số 1;
- Ban Lãnh ñạo Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Khoa Quản lý chất lượng Viện Kiểm Định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Th.S Nguyễn Thị Vân Anh, KTV Lê Thị Kim Thuỷ, KTV Phạm Thị Thu Phương,
Môi trường
LAL Limulus Amebocytes Lysate
(Phản ứng xác ñịnh nội ñộc tố)
NMSL: Nước muối sinh lý
OPV:
Vắc xin bại liệt uống
POLYVAC:
Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm Y tế
SOP Standard Operating procedure
(Qui trình chuẩn)
TRS:
Technical report series
(Các hướng dẫn kỹ thuật của Tổ chức Y tế Thế giới)
TSA: Tryptic soy agar
(Thạch TSA)
TSB: Tryptic soy broth
(Canh thang TSB)
VABIOTECH:
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
VGB Vắc xin viêm gan B
VK: Vi khuẩn
VNNB:
Vắc xin viêm não Nhật Bản
VR: Vi rút
VX: Vắc xin
1.2.7. Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý
1.3. Thử nghiệm vô trùng
1.3.1. Các phương pháp kiểm tra vô trùng
1.3.2. Điều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng
1.3.3. Vai trò của con người trong thử nghiệm vô trùng
1.3.4. Môi trường dùng trong kiểm tra vô trùng
1.3.5. Các chứng âm, chứng dương của thử nghiệm vô trùng
1.3.6. Việc loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế
3
3
3
4
5
5
5
6
6
7
8
9
9
10
10
11
12
13
13
Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.2. Vật liệu
2.2.1. Môi trường, hoá chất
2.2.2. Vắc xin
2.2.3. Chủng mẫu
2.2.4. Trang thiết bị dụng cụ
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.3. Xác ñịnh thể tích môi trường
2.3.4. Xác ñịnh hàm lượng thimerosal của các loạt vắc xin viêm gan B,
viêm não Nhật Bản
2.3.5. Xác ñịnh hàm lượng formaldehyd của các loạt vắc xin viêm gan B,
viêm não Nhật Bản
32
32
33
33
33
35
35
36
36
37
37
1. Về thể tích môi trường
2. Nồng ñộ các chất ức chế trong vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm não Nhật Bản
3. Qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin
4. Hạn chế của ñề tài
68
68
75
77
79
Kết luận
80
Kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
82 DANH MỤC BẢNGTrang
Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng
Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích
VX cấy vào mỗi ống MT
Bảng 1.3: Giới hạn nhiễm VK và nấm của các cấp ñộ sạch
loạt số 2, số 3
Bảng 3.9: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 20 mL/ống…
15
15
17
17
26
27
27
32
34
39
44
44
44
45
46
47
48
49
50
Bảng 3.10: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 30 mL/ống
Bảng 3.11: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 40 mL/ống
Bảng 3.12: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM cấy VGB; thể tích 40
Bảng 3.29: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VNNB……
50
52
53
54
55
56
57
57
58
58
59
60
60
61
61
62
62
63
63
Trang
17
19
19
31
31
45
45
47
51
51
1
hưởng của các chất ức chế bằng cách tăng thể tích môi trường [75]. Tuy nhiên
việc này chưa ñược thực hiện tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh
phẩm Y tế (KĐQG).
Thử nghiệm thẩm ñịnh ñược yêu cầu thực hiện cho từng vắc xin [63].
Vì mỗi vắc xin có chứa các chất ức chế khác nhau với nồng ñộ khác nhau. Do
ñó, cần có một qui trình chung ñể xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp cho
tất cả các vắc xin.
Xuất phát từ nhu cầu trên chúng tôi tiến hành ñề tài "Nghiên cứu thể
tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng một số vắc xin tại Viện Kiểm
ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế" với mục tiêu:
1. Tìm thể tích môi trường thích hợp cho 4 vắc xin ñược lựa chọn nghiên cứu,
cụ thể:
- Vắc xin bại liệt uống (OPV) do Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc
xin và sinh phẩm Y tế (POLYVAC) sản xuất.
- Vắc xin BCG (BCG) do Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất.
- Vắc xin viêm gan B (VGB) do do Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
(VABIOTECH) sản xuất.
- Vắc xin viêm não Nhật Bản (VNNB) do VABIOTECH sản xuất.
2. Đề xuất qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô
trùng vắc xin.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vắc xin
Vắc xin (VX) là những chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên ñặc hiệu
của vi sinh vật gây bệnh, ñược ñưa vào cơ thể người ñể gây miễn dịch chủ ñộng,
phòng các bệnh truyền nhiễm do chính các vi sinh vật tương ứng gây ra.
1.1.1. Các thành phần trong vắc xin
1.1.2. Các chất ức chế trong vắc xin
Các chất ức chế có trong VX bao gồm thimerosal; 2 phenoxy ethanol;
phenol; formaldehyd; cloroform; benzethonium chlorid (phemerol); các loại
kháng sinh như kanamycin, neomycin, polymyxin B. Chúng có mặt trong VX
với chủng loại, số lượng, hàm lượng khác nhau.
Có VX không chứa một loại chất ức chế nào, VD: BCG, ImBCG của
IVAC; HIBERIX, Infanrix của Glaxo Smith Kline (GSK).
Có VX chỉ chứa một chất ức chế như VX thương hàn Vi (Công ty Vắc
xin Đà Lạt), TYPHIM Vi (Sanofi pasteur) chứa phenol; D.T.VAX (Sanofi
pasteur) chứa thimerosal;
Có VX chứa hai chất ức chế. Thuộc loại này có VX uốn ván (IVAC),
mORCVAX (VABIOTECH) chứa thimerosal và formaldehyd; PENTAXIM
(Sanofi pasteur) chứa formaldehyd và 2 phenoxy ethanol,
Có những VX chứa tới ba hoặc bốn chất ức chế như VGB
(VABIOTECH) chứa thimerosal, formaldehyd, neomycin, polymicin;
Infanrix Hexa (GSK) chứa formaldehyd, 2 phenoxy ethanol, neomycin,
polymicin;
Vai trò của các chất ức chế trong VX cũng khác nhau.
Các chất này có thể là chất bảo quản ñược cho vào giai ñoạn cuối của
quá trình sản xuất, ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol, benzethonium
chlorid, [46].
Các chất này cũng có thể là các chất bất hoạt trong quá trình sản xuất
và sót lại, ví dụ: formaldehyd, cloroform. Chúng cũng có thể là các loại kháng
sinh, rất phổ biến trong các VX vi rút. Chất ức chế cũng có thể từ các hoá
chất, môi trường nuôi cấy, dùng trong rất nhiều công ñoạn của quá trình sản
xuất mà người ta không thể kiểm soát hay loại bỏ hết ñược, ví dụ: phenol
trong OPV.
5
này nên việc bảo vệ thành quả này cần ñược thực hiện một cách chặt chẽ. Các
chất ức chế trong OPV bao gồm phenol; kanamycin, neomycin.
1.1.3.3. Vắc xin viêm gan B
VGB là VX tái tổ hợp ñầu tiên trên thế giới [49]. VGB do Vabiotech
sản xuất là VX phòng viêm gan B thế hệ II, ñược sản xuất bằng cách nuôi cấy
tế bào nấm men ñã ñược xử lý bằng công nghệ di truyền có mang gen mã hoá
sinh tổng hợp HBsAg, sau ñó ñược tinh chế và bất hoạt bằng kỹ thuật hoá lý:
siêu ly tâm, sắc ký cột và bất hoạt bằng formaldehyd. HBsAg tinh chế ñược
hấp phụ với hydroxyd nhôm, cuối cùng ñược cho thêm thimerosal làm chất
bảo quản [31], [32]. VX này có tính an toàn cao, ít phản ứng phụ và có tính
sinh miễn dịch cao [1]. VGB có hai chất ức chế là thimerosal và
formaldehyde. Thimerosal ñóng vai trò chất bảo quản, formaldehyde là chất
bất hoạt trong quá trình sản xuất còn sót lại. Tiêu chuẩn ñăng ký hàm lượng
thimerosal của VGB là dưới 0,01 %, formaldehyd dưới 0,02 %.
1.1.3.4. Vắc xin viêm não Nhật Bản
Bệnh viêm não Nhật Bản là một trong những bệnh thường gặp ở trẻ em
Việt Nam, lứa tuổi 1-5 tuổi với tỷ lệ tử vong cao hoặc nếu sống sót ñể lại di
chứng nặng nề về thần kinh. Việc tiêm VX viêm não Nhật Bản (VNNB) cho
trẻ em có ý nghĩa kinh tế và xã hội rất lớn [37]. VNNB cũng tạo ñược hiệu giá
kháng thể cao [35], có khả năng bảo vệ trẻ em khỏi bệnh viêm não Nhật Bản
[36].
VNNB ñược sản xuất tại VABIOTECH theo qui trình công nghệ của
Viện BIKEN, trường Đại học Osaka, Nhật Bản. VX ñược sản xuất từ não
chuột gây nhiễm với VR viêm não Nhật Bản chủng Nakayama NIH. Chủng
Nakayama này có cùng tính kháng nguyên với các chủng viêm não Nhật Bản
phân lập ñược ở não tử thi, ở muỗi trong các vụ dịch viêm não Nhật Bản ở
nước ta từ trước tới 1994 [23]. Huyền dịch VR ñược xử lý với protamin
7
sulfat, bất hoạt bằng formaldehyd, cô ñặc bằng siêu lọc và sau cùng tinh chế
Có rất nhiều thử nghiệm ñể kiểm tra chất lượng VX. Thông thường là
các thử nghiệm nhận dạng; công hiệu; an toàn chung; an toàn ñặc hiệu; chất
gây sốt; vô trùng và các thử nghiệm kiểm tra các tính chất vật lý, hoá học (thử
nghiệm hoá lý). Ngoài ra, một số VX có thêm những thử nghiệm riêng, ñặc
thù cho từng VX, ví dụ: BCG và ImBCG có thử nghiệm kiểm tra ñộ sống và
ñộ ổn ñịnh nhiệt.
1.2.1. Kiểm tra vô trùng
Thử nghiệm vô trùng là thử nghiệm cơ bản nhất trong kiểm ñịnh vắc
xin [42]. Thử nghiệm vô trùng là một qui trình khó khăn và phải ñược
chuẩn bị cũng như thực hiện sao cho loại trừ ñược các kết quả dương tính
giả và âm tính giả [63].
Mỗi loạt VX ñược tiến hành kiểm tra vô trùng ở từng công ñoạn của
quá trình sản xuất, bán thành phẩm và thành phẩm. Chính vì lý do này mà khi
các mẫu VX ñược gửi ñến KĐQG thì tỷ lệ phát hiện ra các loạt VX bị nhiễm
trùng là rất thấp.
1.2.2. Nhận dạng
Mục ñích của thử nghiệm nhận dạng là ñể xác ñịnh xem VX có chứa
loại kháng nguyên ñã ñăng ký hay không. Thử nghiệm nhận dạng có thể ñược
thực hiện trực tiếp bằng cách tìm kháng nguyên hoặc gián tiếp thông qua tìm
kháng thể ñặc hiệu.
Thử nghiệm nhận dạng tìm kháng nguyên có thể ñược thực hiện bằng
phản ứng khuếch ñại gen (polymerase chain reaction: PCR) ñối với các VX
có chứa acid nucleic. Hiện nay, KĐQG có thể sử dụng phương pháp này ñể
nhận dạng ñược hầu hết các VX. Các VX ñã thực hiện nhận dạng theo
phương pháp này như sởi, quai bị, rubella, cúm, viêm gan A, viêm não,
9
Một số VX, việc nhận dạng ñược thực hiện qua việc tìm phức hợp
kháng nguyên-kháng thể bằng phản ứng miễn dịch gắn men (ví dụ: VX phế
cầu, não mô cầu, HiB) hay các phản ứng ngưng kết như VX thương hàn, bạch
nghiệm [29].
1.2.5. Kiểm tra an toàn ñặc hiệu
Chỉ có một số VX cần phải kiểm tra an toàn ñặc hiệu như BCG,
VNNB, dại, Thử nghiệm an toàn ñặc hiệu nhằm kiểm tra các ñộc tính liên
quan ñến ñặc ñiểm gây bệnh của chủng sản xuất. Do ñây là thử nghiệm an
toàn ñặc hiệu nên mỗi VX có qui trình thử nghiệm, cách ñánh giá kết quả
riêng, ñặc trưng cho VX ñó.
VD: BCG ñược tiêm dưới da bụng phải của chuột thí nghiệm. Trong
tiêu chuẩn ñánh giá kết quả, ngoài tiêu chuẩn chung như chuột tăng cân thì
còn phải ñánh giá xem chuột có biểu hiện bệnh lao hay không. Sau 42 ngày
chuột ñược mổ ñể kiểm tra phủ tạng (gan, lách, phổi,…) xem có biểu hiện
nhiễm lao hay không; các hạch có to không; có khác nhau giữa hạch vùng
khoeo, nách, hạch bên trái so với bên phải (bên tiêm VX ) hay không [34].
1.2.6. Kiểm tra chất gây sốt
Thử nghiệm kiểm tra chất gây sốt (Pyrogens) nhằm phát hiện có hay
không tác nhân gây sốt trong VX.
Theo WHO, thử nghiệm này có thể ñược thực hiện trên thỏ hoặc bằng
thuốc thử lysat [78].
Thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ ñược thực hiện dựa trên nguyên tắc so
sánh sự tăng thân nhiệt của hai nhóm thỏ trước và sau khi tiêm VX vào tĩnh
mạch tai thỏ trong vòng 3 giờ [30].
Thuốc thử lysat là dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu một
loài sam biển, là chất nhạy cảm với nội ñộc tố. Dùng thuốc thử lysat chỉ phát
11
hiện ñược chất gây sốt là nội ñộc tố của vi khuẩn. Hiện nay có 3 phương pháp
ñể thực hiện phép thử này: phương pháp tạo gel dựa vào sự hình thành gel khi
cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội ñộc tố, phương pháp ño ñộ ñục dựa
vào sự thay ñổi ñộ ñục của thuốc thử lysat khi tạo gel, phương pháp ño màu
dựa trên sự thay ñổi màu của phức hợp màu-peptid [6].
Hàm lượng Al
+++
ñược ñịnh
lượng dựa trên sự tạo thành muối natri của
acid ethylendiamintetraacetic (EDTA) với ion Al
+++
, sau ñó chuẩn ñộ dung
dịch EDTA thừa bằng dung dịch ñồng sulfat 0,01 M [19].
Hàm lượng muối NaCl ñược xác ñịnh dựa trên phản ứng của ion Cl
-
với
bạc nitrat 0,1 N, chỉ thị màu kalicromat 10% [11].
Thực hiện những thử nghiệm nào trong số các thử nghiệm nói trên là
phụ thuộc vào bản chất của từng VX.
1.3. Thử nghiệm vô trùng
1.3.1. Các phương pháp kiểm tra vô trùng
1.3.1.1. Hai phương pháp kiểm tra vô trùng
Hiện nay, trên thế giới có hai phương pháp kiểm tra vô trùng VX:
Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp [58], [75], [80].
Phương pháp màng lọc là phương pháp dùng một bơm chân không hút
tất cả VX trong các lọ mẫu cần kiểm tra ñi qua một màng lọc có kích thước lỗ
lọc nhỏ hơn 0,45 µm, rửa màng lọc ñể loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách
cho các dung dịch rửa ñi qua, sau ñó nuôi cấy màng lọc trong hai môi trường
FTM và TSB.
Phương pháp cấy trực tiếp ñược thực hiện bằng cách hút một lượng VX
trong mỗi lọ chứa theo một tỷ lệ nhất ñịnh rồi cấy vào các ống môi trường
FTM và TSB.
13
thuộc vào số lượng sản xuất của loạt ñó và thể tích VX có trong mỗi lọ. Số
lượng này ñược WHO qui ñịnh [75]:
Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng
Số lượng (Lọ)Số lượng thành phẩm
của một loạt (Lọ)
Lượng VX trong mỗi lọ
≥ 2 mL
Lượng VX trong mỗi
lọ < 2 mL
< 100
10% nhưng không ít hơn
4
20% nhưng không ít
hơn 8
≥ 100 và < 500 Ít nhất 10 Ít nhất 20
≥ 500 Ít nhất 20 Ít nhất 40 Công thức tính cỡ mẫu chung mà WHO ñưa ra là :
Nn 4,0=
,
trong ñó: n là số lọ VX cần lấy, N là số lượng VX thành phẩm trong một loạt.
Trong phương pháp cấy trực tiếp, lượng VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy
vào mỗi loại MT (FTM, TSB) và lượng VX cấy vào mỗi ống MT cũng ñược
qui ñịnh tại tài liệu WHO TRS 530 annex 4 [75], cụ thể như sau:
Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích
WHO, Dược ñiển châu Âu chia phòng sạch làm 4 cấp ñộ: A, B, C, D
dựa theo kết quả giám sát môi trường phòng sạch [43], [71].
Các nội dung giám sát môi trường phòng sạch bao gồm: ñếm số lượng
VK và nấm trong không khí, ñếm số lượng VK và nấm trên bề mặt phòng
sạch và găng của cán bộ thực hiện thử nghiệm, ñếm số lượng hạt bụi trong
không khí.
- Đếm số lượng VK và nấm trong không khí bằng 2 phương pháp:
+ Phương pháp thụ ñộng bằng cách ñặt các ñĩa thạch ở các vị trí có khả
năng lây nhiễm khác nhau trong 4 h.
+ Phương pháp chủ ñộng: dùng máy lấy mẫu không khí ñể hút không
khí qua máy. VK và nấm trong không khí sẽ gắn vào ñĩa thạch hoặc màng
gelatin lắp sẵn trong máy. Màng gelatin sau ñó ñược ñặt lên ñĩa thạch. Ủ các
ñĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc trên ñĩa thạch. Dựa vào vận tốc lấy
mẫu, thời gian lấy mẫu ñể tính số VK và nấm có trong mỗi mét khối không
khí. Đây là phương pháp chính xác nhưng ñòi hỏi phải có trang thiết bị ñắt
tiền.
- Xác ñịnh VK và nấm trên bề mặt: lấy ñĩa thạch tiếp xúc có ñường kính 56
mm, mở nắp ñĩa thạch và cho mặt thạch tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra
trong giây lát. Đóng nắp ñĩa thạch. Ủ ñĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc
trên ñĩa thạch.
- Kiểm tra găng của kỹ thuật viên: mỗi kỹ thuật viên dùng một ñĩa thạch riêng
biệt, in 10 ñầu ngón tay của mình vào ñĩa thạch theo trình tự tay phải in trước,
tay trái in sau, tay phải ở giữa ñĩa thạch, tay trái bao phía ngoài.
16 Hình 1.1: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên
- Đếm số lượng hạt bụi trong không khí: dùng máy ñể ñếm số lượng các hạt
bụi kích thước 0,5 - 5 µm và các hạt có kích thước ≥ 5 µm.
Tiêu chuẩn từng cấp ñộ sạch như sau:
Hạt 0,5-5 µ
µµ
µm Hạt ≥ 5 µ
µµ
µm Hạt 0,5-5 µ
µµ
µm Hạt ≥ 5 µ
µµ
µm
A 3500 0 3500 0
B 3500 0 350.000 2000
C 350.000 2000 3.500.000 20.000
D 3.500.000 20.000 Không thực hiện
Copyright: Tài liệu đại học ©