BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
PHẠM NHƯ THÙY
KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA VACXIN TỤ
DẤU LỢN NHƯỢC ðỘC SẢN XUẤT TẠI XÍ NGHIỆP
THUỐC THÚ Y TRUNG ƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨHÀ NỘI, NĂM 2013
TS. TRẦN THỊ LAN HƯƠNG
HÀ NỘI, NĂM 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan, các số liệu cũng như kết quả trong luận văn này là trung
thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ luận văn nào khác. ðề tài này ñược
chính tôi thực hiện với sự giúp ñỡ của các ñồng nghiệp. Các thông tin trích dẫn
trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ñang giảng dạy cho
học viên cao học chuyên ngành Thú y - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo
ñiều kiện cho tôi ñược thực hiện ñề tài này.
Xin chân thành cảm ơn TS. Trần Thị Lan Hương ñã hướng dẫn nghiên cứu
khoa học tận tình ñể tôi hoàn thành ñề tài này một cách tốt nhất.
Qua ñây tôi cũng xin ñược gửi lời cảm ơn tới Ban giám ñốc Xí nghiệp thuốc
Thú y Trung ương cùng toàn thể ñồng nghiệp trong cơ quan ñã tạo mọi ñiều kiện ñể
tôi tiến hành thí nghiệm, thu thập số liệu làm tài liệu báo cáo.
Tôi vô cùng biết ơn và trân trọng sự giúp ñỡ tận tình quý báu ñó.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả Phạm Như Thuỳ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1.1.1. Bệnh Tụ huyết trùng lợn 3
1.1.2. Bệnh ðóng dấu lợn 4
1.2. ðặc tính sinh học của vi khuẩn Tụ huyết trùng và vi khuẩn ðóng dấu 7
1.2.1. ðặc tính sinh học của vi khuẩn Tụ huyết trùng 7
1.2.2. ðặc tính sinh học của vi khuẩn ðóng dấu 15
1.3. Vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng, ðóng dấu lợn 19
Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. ðối tượng nghiên cứu 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 22
2.3. Nguyên liệu nghiên cứu 22
2.4. Phương pháp nghiên cứu 23
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng môi trường vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc 29
3.2. Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc 35
3.2.1. Kết quả xác ñịnh số lượng vi khuẩn THT và ðD lợn trong canh khuẩn
vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc sau khi nuôi cấy 48 giờ 36
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viTrường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CFU: Colony forming unit
CNF: Cytotoxic necrotizing factors
DNT: Dermonecrotic toxin
IL: Interleukin
LPS: Lipopolysaccharide
MHC: Major histocompatibility complex
MLD: Minimum lethal dose
M: Mucoid
PI: Protective index
Pmt: Pasteurella multocida toxin
R: Rough
RTX: Repeats in toxin
S: Smooth
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis
SPF: Specified-pathogen-free (Sạch bệnh)
TNF: Tumor necrosis factor
Md: Miễn dịch
THT: Tụ huyết trùng
ðD: ðóng dấu
ð/c: ðối chứng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3.8. Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc sau thời gian lưu
kho 9, 10 tháng ở 2-8
0
C 69
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ix
DANH MỤC HÌNH
Trang
2.1. Sơ ñồ pha loãng và cấy canh khuẩn vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc 25
3.1. Tiến trình sản xuất vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc tại Xí nghiệp thuốc Thú y
Trung ương 30
3.2. Biến ñộng số lượng vi khuẩn THT và ðD lợn sống trong vacxin Tụ Dấu lợn
nhược ñộc sau thời gian lưu kho ở 2-8
0
C (Lô vacxin I) 60
3.3. Biến ñộng hiệu lực của vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc sau thời gian lưu kho
ở 2-8
0
C (Lô vacxin I) 71Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
x
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
22. Mục ñích nghiên cứu của ñề tài
- Xác ñịnh ñược một số chỉ tiêu của vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc: chất
lượng môi trường, thuần khiết, an toàn, hiệu lực.
- Xác ñịnh ñược thời gian bảo quản vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Kết quả của ñề tài ñưa ra ñược các thông tin cần thiết trong sản xuất và bảo
quản vacxin Tụ Dấu lợn nhược ñộc sản xuất tại Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương.
Là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng, ðóng dấu
trên ñàn lợn ñạt hiệu quả cao.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Tụ huyết trùng và ðóng dấu lợn
1.1.1. Bệnh Tụ huyết trùng lợn
Bệnh Tụ huyết trùng xảy ra trên lợn, nguyên nhân do vi khuẩn Pasteurella
multocida gây ra. ðặc ñiểm của bệnh gây bại huyết, xuất huyết. Vi khuẩn tác ñộng
tới bộ máy hô hấp, gây thuỳ phế viêm. Triệu chứng, bệnh tích ñặc trưng tập trung ở
bộ máy hô hấp. Theo số liệu hiện nay tại Mỹ, tiến hành ñiều tra trên tổng số 6.634
lợn ñược giết mổ thì có ñến 75% lợn có biểu hiện viêm phổi và 13% lợn bị viêm
màng phổi (Barbara và cộng sự, 2006b).
1.1.1.1. Dịch tễ học
Thể mạn tính, ñây là thể bệnh phổ biến, ñược mô tả với biểu hiện ho, thở thể
bụng, sốt nhẹ. Thể này thường diễn ra ở lợn ñang trong tuổi lớn (trên 16 tuần tuổi).
1.1.1.4. Bệnh tích
Thể ñiển hình, khi mổ khám có thể quan sát thấy khí quản chứa ñầy bọt, bề
mặt phổi phân thành hai vùng rõ rệt giữa vùng phổi bị viêm và phổi bình thường.
Vùng phổi bị viêm chuyển màu từ ñỏ sang màu xám xanh, màu sắc ñậm nhạt tùy
thuộc vào mức ñộ tiến triển của viêm. Trường hợp nặng có thể xuất hiện hiện tượng
viêm dính màng phổi, hình thành các khối áp xe khác nhau, màng viêm dính có màu
trắng ñục, ráo nước. Trường hợp viêm dính màng phổi do Actinobacillus thì bề mặt
phổi có màu vàng, ướt và có sự thâm nhiễm fibrin (Barbara và cộng sự, 2006b).
1.1.2. Bệnh ðóng dấu lợn
Bệnh ðóng dấu lợn (Swine Erysipelas) do vi khuẩn Erysipelothrix
rhusiopathiae gây ra, xuất hiện ở thể bại huyết cấp tính hoặc á cấp tính. Thể mạn
tính hình thành tổn thương ñặc trưng.
Ở người, vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae gây ra bệnh Erysipeloid với
các dấu hiệu tổn thương trên da. Chúng gây nên bệnh nghề nghiệp ở những người
tham gia chế biến thịt, giết mổ gia cầm, cá và tôm hùm, cũng như những người làm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5
việc trong các nhà máy tái chế sản phẩm có nguồn gốc từ ñộng vật, nhân viên thú y,
những người xử lý, giết mổ ñộng vật săn bắt, công nhân thuộc da, nhân viên phòng
thí nghiệm. Thỉnh thoảng vi khuẩn này ñược phân lập từ những người mắc bệnh
viêm nội tâm mạc. Hiếm khi vi khuẩn gây bệnh ở thể bại huyết cấp tính trên người
(Barbara và cộng sự 2006a).
1.1.2.1. Dịch tễ học
Lợn là loài mang vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae. Con vật mang
trùng, ñào thải vi khuẩn ra ngoài môi trường qua phân hoặc chất tiết từ mũi, miệng.
Rất nhiều loài chim và ñộng vật có vú hoang dã mang vi khuẩn Erysipelothrix
rhusiopathiae. Những ñộng vật này trở thành nguồn bệnh tiềm tàng. Vai trò của ký
mắc bệnh thường tách khỏi ñàn và nằm bẹp một chỗ. Dáng ñi khó nhọc, khập
khiễng. ða số vật mắc bệnh ñều biếng ăn hoặc bỏ ăn hoàn toàn. Hiện tượng sảy thai
có thể diễn ra ở con nái ñang mang thai khi mắc bệnh thể cấp tính hoặc á cấp tính.
Tổn thương trên da xuất hiện sớm ở ngày thứ hai và thường là ngày thứ ba
sau khi bị phơi nhiễm Erysipelothrix rhusiopathiae. Ở lợn có màu da sáng, quan sát
trên bề mặt da thấy những vùng tổn thương (nốt ban xuất huyết) có màu hồng cho
ñến màu tím sẫm nổi gồ trên bề mặt, sờ vào có cảm giác cứng chắc. Sau 4-7 ngày
lớp da tại vùng tổn thương sẽ tróc vảy. Những nốt ban xuất huyết riêng lẻ phát triển
mở rộng kích thước tạo ra hình thù ñặc trưng, hình vuông hoặc hình thang. Nốt ban
có màu từ hồng cho ñến ñỏ tươi ñặc trưng cho thể cấp tính không gây chết, ngược
lại những nốt ban viêm tấy màu ñỏ tía thường là dấu hiệu báo trước cho thể cấp tính
gây tử vong. Trong thể cấp tính gây tử vong các nốt ban màu ñỏ tía thường xảy ra ở
vùng da bụng, tai, mặt sau của thân, mặt ngoài phía sau ñùi, má.
Thể á cấp tính, các dấu hiệu lâm sàng diễn ra ở mức ñộ ít nghiêm trọng hơn
so với thể cấp tính. Vật mắc bệnh, thân nhiệt tăng nhẹ. Thể mạn tính có thể xảy ra
sau thể cấp tính hoặc á cấp tính hay thể cận lâm sàng. Thể mạn tính ñược mô tả bởi
triệu chứng viêm khớp như: khớp cứng, sưng. Dấu hiệu này xuất hiện sau khoảng 3
tuần mắc bệnh.
1.1.2.4. Bệnh tích
Trong thể cấp tính, bệnh tích ñại thể bao gồm các nốt ban xuất huyết trên da,
chúng thường xuất hiện ở những vùng da mõm, tai, má, cổ, bụng, ñùi. Phổi có thể bị
sung huyết, phù. Màng bao tim, cơ tâm nhĩ xuất huyết ñiểm và bầm huyết, ñặc biệt
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
7
là ở cơ tâm nhĩ trái. Dạ dày viêm cata, xuất huyết, có thể xuất hiện hiện tượng xuất
huyết màng thanh dịch dạ dày. Gan sung huyết. Lách sung huyết, giãn rộng, rõ nhất
ở những con bị mắc bệnh sau vài ba ngày. Xuất huyết ñiểm ở miền vỏ thận có thể
xảy ra. Niêm mạc bàng quang ñôi khi có những vùng bị sung huyết. Hạch lympho
thường bị viêm cấp tính với biểu hiện sung huyết và xuất huyết.
multocida không có giáp mô phát dung quang màu xanh, khuẩn lạc dạng S (ñường
kính 1-2mm) của Pasteurella multocida có giáp mô mỏng phát dung quang sắc cầu
vồng. Pasteurella multocida có lớp giáp mô rộng hình thành khuẩn lạc dạng M
(Brogden, 1980).
1.2.1.2. Cấu trúc và thành phần
Lớp giáp mô của Pasteurella multocida type A chứa thành phần
polysacharide, axít hyaluronic. Giáp mô của vi khuẩn Tụ huyết trùng type D chứa
heparin và giáp mô của type F có chứa chondroitin (Dwight và cộng sự, 2004).
Những chất này giống với thành phần nằm trong cấu trúc mô bào vật chủ, tính
kháng nguyên yếu, liên kết yếu với phức hợp bổ thể do ñó giúp cho vi khuẩn có khả
năng kháng lại sự thực bào. Bên cạnh ñó lớp giáp mô chứa axít hyaluronic còn có
lợi cho sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô ñường hô hấp, ñiển hình là
giáp mô của Pasteurella multocida type A. Một số chủng thuộc loài Pasteurella
multocida và Pasteurella haemolytica xuất hiện các yếu tố bám dính.
Thành tế bào vi khuẩn ñược cấu tạo chủ yếu từ lipopolysaccharide và
protein. Một số protein là yếu tố ñiều hòa nguyên tố sắt, chúng xuất hiện dưới ñiều
kiện nghèo sắt.
1.2.1.3. Các yếu tố gây bệnh
Vi khuẩn Tụ huyết trùng sản sinh một số các chất gây bệnh cho cơ thể vật
chủ. Trong số này, quan trọng nhất là lớp giáp mô, lipopolysaccharide, protein ñiều
hòa sắt, protein ñộc tố màng ngoài, yếu tố bám dính, leukotoxin và các enzym gây
bệnh hyaluronidase, neuraminidase (Dwight và Zee, 1999b).
Lớp giáp mô ñóng vai tròng quan trọng, ñặc biệt là ngăn cản sự thực bào,
bảo vệ lớp màng ngoài thoát khỏi sự gắn kết với phức hợp tấn công màng hình
thành từ quá trình hoạt hóa hệ thống bổ thể (Dwight và cộng sự, 2004), cũng như
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9
ngăn cản quá trình opsonize bởi collectin hay ficollin. Lượng giáp mô ñược sản sinh
ra tỷ lệ nghịch với số lượng sắt khả dụng. Trong cơ thể hàm lượng sắt khả dụng rất
siderophore vẫn chưa ñược khẳng ñịnh có ở các vi khuẩn Tụ huyết trùng khác. Mặc
dù vậy, hầu như tất cả vi khuẩn Tụ huyết trùng ñều gắn phức hợp vận chuyển sắt
nhờ vào ái lực của protein ñiều hòa sắt nằm trên màng ngoài, protein này xuất hiện
trong ñiều kiện thiếu sắt. Sắt ñược cung cấp cho vi khuẩn thông qua phức hợp vận
chuyển sắt gắn trên bề mặt vi khuẩn (Dwight và Zee, 1999b).
Pasteurella haemolytica sản sinh leukotoxin, ñây là chất ñóng vai trò quan
trọng trong quá trình gây bệnh. Leukotoxin là một ñộc tố có bản chất protein, trọng
lượng phân tử khoảng 104 kDa, thuộc nhóm ñộc tố RTX. ðặc ñiểm phổ biến của
ñộc tố này là trong cấu trúc của protein chứa nhiều glycine. Hậu quả sinh học do
leukotoxin gây ra bao gồm gây ñộc tế bào bạch cầu khi leukotoxin ở nồng ñộ cao và
ngược lại hoạt hóa bạch cầu khi leukotoxin ở nồng ñộ thấp, kích hoạt apoptosis ở
bạch cầu và làm giảm khả năng ñiều hòa của protein MHC II gắn trên bề mặt ñại
thực bào ảnh hưởng tới khả năng trình diện kháng nguyên (Dwight và Zee, 1999b).
Sự hoạt hóa ñại thực bào dẫn ñến giải phóng các chất tiết tiền viêm TNF và IL-1,
kích thích các bạch cầu ña nhân giải phóng H
2
O
2
chuyển Fe
2+
thành gốc hydroxyl,
gốc hydroxyl giết chết tế bào dẫn ñến tích tụ dịch phù và fibrin.
Pasteurella multocida sản sinh ñộc tố Pmt thuộc nhóm ñộc tố RTX, ñộc tố
này còn ñược biết ñến như ñộc tố DNT, ñộc tố gây hoại xương. Trên lợn mắc thể
viêm dính màng phổi, yếu tố ñộc lực ñược xác ñịnh là ñộc tố DNT. ðộc tố Pmt
tương ñồng với ñộc tố CNF-1, CNF-2 của E. coli (Dwight và Zee, 1999b). Thuộc
vào nhóm ñộc tố RTX, Pasteurella trehalosi trên môi trường thạch máu sản sinh
ñộc tố leukotoxin làm tan hồng cầu, leukotoxin gắn vào CD18 (aβ
2
integrin) có trên
trong môi trường nuôi dưỡng. Ủ ấm (35-37
0
C) qua ñêm, vi khuẩn phát triển tạo
thành khuẩn lạc có ñường kính khoảng 1mm, màu sáng, dạng S hoặc M.
Pasteurella multocida không dung huyết trên thạch máu, không mọc trên môi
trường thạch MacConkey. Pasteurella haemolytica và Pasteurella trehalosi sản
sinh tan huyết tố, làm tan hồng cầu trên thạch máu bò. Pasteurella haemolytica mọc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12
trên môi trường thạch MacConkey hình thành khuẩn lạc nhỏ như ñầu kim, màu ñỏ
(Quinn và cộng sự, 2004b).
Trên môi trường nước thịt peptone, sau khi ủ ở 37
0
C trong vòng 24 giờ, vi
khuẩn phát triển làm ñục nhẹ môi trường, khi lắc vẩn như khói, sau vài ngày lắng
xuống tạo thành cặn. Một số chủng tạo lớp màng mỏng ở phía bề mặt tiếp xúc môi
trường.
1.2.1.5. Sức ñề kháng
Trong canh khuẩn, vi khuẩn sẽ chết sau 1-2 tuần. Vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh
chóng bởi các chất sát trùng, nhiệt ñộ 50
0
C/30 phút, tia tử ngoại. Pasteurella
multocida sống sót ñược vài tháng trên xác gia cầm.
ðặc biệt, trong máu của ñộng vật, ban ñầu Pasteurella spp. mẫn cảm với
Penicillin, Tetracycline và Sulfonamide nhưng sau ñó chúng tăng dần sức kháng,
kháng lại lần lượt các kháng sinh kể trên. Gen mã hoá sức ñề kháng với
Tetracycline chỉ có ở vi khuẩn Tụ huyết trùng . Gen mã hoá sức ñề kháng thường
liên quan tới R plasmid (Dwight và Zee, 1999b).
1.2.1.6. Biến chủng
Thấp
Serotype
1, 2, 5, 6, 7, 8, 9,
11, 12, 13, 14, 16
3, 4, 10, 15
Khu trú trên vật chủ
Mũi-hầu Hạch amidan
Khả năng gây bệnh
Viêm phổi ở trâu bò, cừu; gây
nhiễm trùng huyết ở cừu non
mới sinh
Nhiễm trùng huyết ở cừu
trưởng thành
biotype A ñược phân loại vào giống Mannheimia và nó ñược ñịnh danh là
Mannheimia haemolytica (Carter và Wise, 2004b). Pasteurella haemolytica không
gây phản ứng ngưng kết chéo với Pasteurella multocida (Robert và cộng sự, 1957).
Mannheimia haemolytica và Pasteurella trehalosi gây bệnh phổ biến trên
trâu, bò. Thể bại huyết xuất huyết gây ra bởi Pasteurella multocida serotype B:2 ( ở
Nam Á và ðông Nam Á) hoặc E:2 (ở Châu Phi).
Copyright: Tài liệu đại học ©