ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
**** ĐỖ HOÀNH QUÂN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC
TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN
AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ NGÀNH: 60.42.30
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
khó khăn trong cuộc sống.

Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2011
Đỗ Hoành Quân ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. Azotobacter
IAA Indol acetic acid
ATP Adenosin triphosphate
ADP Adenosin diphosphate
rH
2
Lưu lượng khí hydrogen
pO
2
Áp suất khí oxygen
PCR Polymerase chain reaction
OD Optical density
CFU Colony froming units
TB Giá trị trung bình
SD Độ lệch chuẩn thực nghiệm. iii


2+

ở các nồng độ khác nhau 71
Bảng 3.15. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi
nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 74
Bảng 3.16. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 75 iv

Bảng 3.17. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi
cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau 77
Bảng 3.18. Hàm lượng nitơ cố định được (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau. 79
Bảng 3.19. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại
các thời điểm nuôi cấy khác nhau 81
Bảng 3.20. Hàm lượng nitơ tổng cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 82
Bảng 3.21. Hàm lượng nitơ cố định được và sự tồn tại của các
chủng Azotobacter trong đất sau 45 ngày 84
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng Az 03 và Az 07
lên sự phát triển của cây cải xanh 85


Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng
cố định nitơ của chủng Az 07 69
Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 70
Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 71
Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 72
Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 72
vi

Mở đầu

- 1 -

MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề

Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí
N
2
với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp
được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững
trong phân tử N
2
, tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được.
Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực
hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của
nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém,
gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc
nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào
trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu.
Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng
cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase.
Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn
đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá
trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N
2
trong không khí thành NH
3

 Nội dung thực hiện:
- Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai,
Long An, Tiền Giang, Bến Tre.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập.
- Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao.
- Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của
chủng chọn lọc.
- Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea).

thành đạm ở dạng hữu hiệu [6].
Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều. Phần lớn phân người và
gia súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa
trôi, cuối cùng chảy vào biển. Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có
nguồn gốc từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật hầu như
không thể sử dụng được [6].
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử N
2
, dạng nguyên tử kép (N
2
)
được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần
nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO
3
-
và NH
4
+
. Để sử dụng
được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học [6].
 Hóa học: Kể từ năm 1920, biện pháp công nghiệp Haber-Bosch đã giúp con
người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao
(450 - 500
o
C), áp suất lớn gấp 400 lần áp suất khí quyển và Fe
3+
là chất xúc tác [40]. Các
hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và
ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm được tổng hợp hóa học cho nông
nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại vô cùng to

(10
12
g/năm)
Không phải con đường sinh học
(Non-biologital)
80
Công nghiệp (Industrial) 50
Sự cháy (Combustion) 20
Chớp hay sét (Lightning) 10
Con đường sinh học (Biologital) 175
Đất nông nghiệp 90
Đất rừng và không phải nông nghiệp 50
Biển 35 Tổng quan tài liệu

- 5 -

1.1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục,
ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các
chất khô của thực vật dao động từ 1-3%. Tuy
hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai
trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống
sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất
của cây trồng [3].
Sự thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém,
chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá
vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm

NO
2
-

Vi khuẩn nitrat hóa
Nitrosomonas
NO
2
-

NO
3
-

Nitrobacter
a b

Hình 1.1. Cây lúa, không bón đạm (a);
có bổ sung đạm (b).
Tổng quan tài liệu

- 6 -

1.1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa
Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác
dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ [38]. 1.1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống

3
-

Vi khuẩn phản nitrat hóa
N
2
N
2
+ H
2
Nitrogenase
Vi khuẩn cố định đạm
NH
3
H
2
O
NH
4
+

Không khí
Tổng quan tài liệu

- 7 -

1.2. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ
1.2.1. Phân loại
Vi khuẩn cố định nitơ được phân ra thành ba nhóm nhỏ: nhóm vi khuẩn sống cộng
sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ. Tuy

đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác
bắt buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa cố định
nitơ cộng sinh và nitơ tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn
sống tự do trong vùng lân cận rễ cây thực vật đến những vi sinh vật sống nội sinh trong
mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ của vi sinh vật tương tác có thể diễn ra cần
những yêu cầu sau đây [10]:
+ Thực vật ký chủ
+ Chất nền thực vật
+ Môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động.
+ Quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng.
Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như:
Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và
Klebsiella [10].
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ
Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ
cung cấp đạm cho cây trồng. Bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến
với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như:
- Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC
deaminase (1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase), hay tạo ra các hormone
thực vật như auxin, cytokinin và gibberellin. Đặc biệt các chủng Azotobacter kích thích
sự nẩy mầm của hạt và giúp phát triển hệ rễ của cây trồng [18, 22].
- Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh
tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh
sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ [18,20, 22].
- Ngoài ra, chúng còn giúp cây trồng hấp thu hiệu quả các ion như sắt, kẽm và các
nguyên tô vi lượng khác [24].


C. Nhiệt độ cố định nitơ tốt nhất
là 35
0
C, tế bào phát triển trong khoảng pH 6.2 – 8.0 và tối ưu ở pH 7.2. Khả năng sử
dụng nguồn carbon bao gồm fructose, galactose, glucose, sucrose, mannitol, melibiose,
0.25% sodium benzoate và tinh bột. Nguồn nitrate và amomonium được sử dụng như
nguồn nitơ. Sắc tố màu nâu nhạt đến nâu đen được tạo thành bởi hầu hết các chủng khi
chúng phát triển trên môi trường vô đạm và thông khí tốt [14, 23].
Tổng quan tài liệu

- 10 -
- A. paspali (Dobereiner, 1966): đặc điểm hình thái giống với các chủng loài
Azotobacter khác, nhưng tế bào dài hơn, kích thước tế bào thường 5 – 10 µm, có thể dài
tới 60 µm. Tế bào di động bởi chu mao (peritrichous flagella). Khuẩn lạc thường mờ đục
với đường mép liên nhau hoặc lượn sóng, thường không nồi và bề mặt nhám. Có thể sử
dụng ammonium nhưng không sử dụng được glutamate như là nguồn nitơ duy nhất cho
sự tăng trưởng. Theo Thompson và Skerman (1979),Nguồn carbon sử dụng được bao
gồm maltose, trihalose, raffinose, mannitol [14, 23].
- A. nigricans (Krasil’ nikov, 1949): Tế bào hình que đầu tròn, không di động và
không có tiêm mao. Khuẩn lạc thường trơn, nhưng có thể thay đổi do lượng
polysaccharide ngoại bào. Hầu hết tế bào mờ đục nhưng có thể trong mờ. Sắc tố được
tạo ra thường có màu đỏ tím. Tăng trưởng yếu hoặc không tăng trưởng ở 37
0
C.
Ammonium và nitrate được sử dụng như là nguồn nitơ thích hợp. Loài này mang gen nif
và vnf nhưng không có anf, có khả năng tổng hợp nitrogenase-1 và nitrogenase-2 [14,
23].
- A. armeniacus (Thompson và Skerman, 1981): đặc điểm hình thái của loài này
giống hầu hết các chủng khác. Tế bào di động bằng chu mao, khuẩn lạc mờ đục, rất nhầy
và bề mặt nhám nhiều hơn các chủng khác. Sắc tố tan trong nước màu nâu đen đến đỏ


A.
chroococcum
A.
armeniacus
A.
beijerinckii

A.
nigricans
A.
paspali
A.
salinestris
A.
vinelandii
Sắc tố tan trong nước
Vàng xanh
Xanh
Nâu đen
Nâu đen đến đỏ tím
Đỏ tím
Khử nitrate thành nitite
Nguồn carbon
D-Glucuronate
D-Galacturonate
Glutarate
Glycolate
Phenol
Rhamnose

-
+
d
-
-
-
-
+
+
-

-
-
-
-
-
+

+
+
-
-
d
-
-
-
+
-

-

-
-
-
-

-
-
+
-
-
+

+
nd
nd
nd
nd
-
nd
nd
nd
nd

+
d
-
-
d
+


C
14
0
C
18
0
C
32
0
C
37
0
C
Sản xuất polysaccharide ngoại bào
Peroxidase
Urease
Oxidase
Tạo H
2
S từ:
Thiosulfate
Cysteine
Sử dụng như nguồn carbon duy nhất
Fuctose, glucose, acetate, pyruvate,
fumarate, malate, succinate,
α-oxoglutarate, lactate, DL-gluconate,
hoặc methylcarbinol.
Sucrose
Propionate
β-Phenylpropionate

+

d
- + +
+
d
+
-
d
d
d
+
+
-
+
+
+
+

-
-
+
d


+
d
d
d
-
-

d
+
+
+

+
+
-

d
+
+
+
-
d
d
+
+

d
-
+
+
-
+
d
+
+

d
- + +
-
-
d
-
d
-
+
d
d
-
-
-
+
+

-
-
-
-
-
-
-
nd
nd
nd
+
+

-
d
+
-

d
d
nd

-
-
-
d
+
d
+
+

+
+
+

-
+
+
+
+
d
+
+
+

+
d + +
+
+
+
+
d
+
-
+

Sodium fluoride, 0.01 M
HgCl
2
, 10 µg/ml
Iodacetate, 1 mM
Erythromycin, 2 µg/ml
Neomycin hoặc kanamycin, 1 µg/ml
Sinh bào xác
Sinh vỏ nhầy
Tỷ lệ %G+C trong DNA
+
d
+
d
+
+

S
d
d
d
d
R
d
d
d
S
S
S
+

d
d
d

S
d
d
d
d
d
d
R
d
S
d
S
+
+
66.0 –
66.2
d
d
d
-
d
d

S
d
R

S
nd
+
63.2 –
64.6
nd
nd
nd
-
nd
nd

S
nd
R
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
S
nd
+
65.19 –
65.98
d
+

chúng phát triển trên môi trường có
bổ sung chiết nấm men – peptone
agar thường tạo ra các tế bào biến
dạng [14].
Azotobacter tăng trưởng dưới điều kiện cố định nitơ thường có kích thước nhỏ hơn
khi phát triển trên môi trường có ammonia. Azotobacter thường tồn tại ở dạng đơn, hoặc
đôi hoặc thành từng nhóm không đều (A. paspali), hiếm khi tồn tại dạng chuỗi [14]. Khi
già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng
hình cầu, tế bào được bao bọc bởi một lớp vỏ nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng
75% là chất hydrid của uronic acid và chỉ chứa khoảng 0,023% nitơ và sinh chất xuất
hiện nhiều hạt lổn nhổm, đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… [19].
Khuẩn lạc của Azotobacter thường trơn, bóng, đục, lồi và nhầy. Khi còn non khuẩn
lạc có màu trắng đục, sau đó dần dần chuyển sang màu vàng hoặc nâu đen. Tuy nhiên
các đặc điển trên có thể thay đổi trong một số trường hợp. Như A. vinelandii, các khuẩn
lạc biến thể nhỏ hơn có thể xuất hiện do sự tạo thành polysaccharide ngoại bào giảm. A.
armeniacus thỉnh thoảng tạo ra những khuẩn lạc trong mờ (translucent) và khuẩn lạc A.
paspsli dạng viền gợn sóng (undulate edged) và lồi không đều (unevenly convex) với bề
mặt xám hoặc nhám. Trên môi trường có sucrose hoặc raffinose, tùy thuộc vào chủng
giống thì có sự tạo thành các homopolysaccharide, chúng có thể khuếch tán ra xung
quanh khuẩn lạc. Theo Thompson và Skerman (1979) loài A. chrococcum và một số
chủng thuộc loài A. beijerinckii và A. nigricans tạo ra các homopolysaccharide khuếch
tán từ cả hai loại đường trên, trong khi đó loài A. meniacus và một số chủng thuộc loài
Hình 1.4. Tế bào sinh dưỡng chủng A. paspali
Tổng quan tài liệu

- 15 -
A. beijerinckii và A. nigricans khác tạo ra các homopolysaccharid khuyếch tán khi môi
trường có bổ sung nguồn sucrose [14].
1.3.5. Sự hình thành bào xác (cyst)
Bào xác được hình thành ít hơn 1% số tế bào ở cuối pha ổn định khi nuôi cấy trên
glucose hoặc mannitol. Sự hình thành nang bào xác (encystment) có thể lớn hơn 90%
sau khi bổ sung butan-l-ol hoặc β-hydrobutyrate vào môi trường nuôi cấy (Lin và Sadoff,
1968). Sự có mặt isopropanol có thể tốt hơn cho chủng A. chrococcum (Marengo, 1983)
[25]. Trong thời gian kết bào xác thì hầu
hết các hoạt động trao đổi chất bị ngưng
lại. Chúng có sức chịu đựng khô hạn và
sự hủy hoại do tác nhân vật lý và hóa
chất tốt hơn đáng kể so với tế bào sinh
dưỡng (Socolofsky và Wyss, 1962). Khi
nghiên cứu cấu trúc siêu vi, cho thấy
chúng được cấu thành từ một cơ quan
trung ương (central body)
có chứa β-hydrobutyrate bao quanh bởi lớp trong và lớp ngoài giống màng bao
(capsule), với alginate là thành phần chủ yếu. Sự lắng đọng vật liệu của vỏ và các thành
phần màng trong trường hợp không phân chia tế bào tạo ra lớp màng bao bên ngoài
(exine coat) (Hitchins và Sadoff, 1970). Các túi bên trong di chuyển ra phía màng ngoài
nơi chúng hình thành một lớp màng ở bên trong. Các túi này có thể đã được tạo ra trong
thời gian tế bào sinh dưỡng (Vela và cộng sự, 1970). Quan sát này cung cấp những bằng
chứng cho thấy bào xác chỉ đơn giản là tế bào sinh dưỡng ở trạng thái nghỉ ngơi và
chúng không giống bào tử vi khuẩn. Theo Lin và Sadoff (1969), thành phần của lớp
màng bao bên ngoài ở A. vinelandii bao gồm: 32% carbohydrate, 28% protein và 30%
lipid [14, 25].
1.3.6. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
1.3.6.1. Khả năng sử dụng nguồn carbon
Khả năng sử dụng đa dạng nguồn carbon của loài Azotobacter là rất quan trọng đối
công việc nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt, nguồn carbon có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả của việc cố định nitơ phân tử [14]. Azotobacter có thể sử dụng các hợp chất alcohol
(ethanol, propanol, butanol, 2,3-butylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol, inositol);

Pseudomonas đã xác định [14].
Việc sử dụng các nguồn carbon như trên rất có ý nghĩa trong việc định danh loài, như
loài A. chrococcum có khả năng đồng hóa tốt lactose và glycerol, trong khi A.
beijerinckii lại sử dụng tốt mannitol và tinh bột. A. agile dường như chỉ sử dụng hạn chế
một số nguồn carbon nào đó, chúng lựa chọn nguồn carbon hơn các loài khác, chúng
không sử dụng mannitol và benzoate [34]. A. insigne bị giới hạn bởi ethanol và acid hữu
cơ đặc biệt là formic acid và benzoic acid [19].