Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

I

BÁO CÁO NGHIỆM THU
Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu
sao Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis)
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Tiến Bằng
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng
Kinh phí được duyệt: 80.000.000
Kinh phí đã cấp: 72.000.000 theo TB số : 224 TB-SKHCN ngày 02/ 12 /2010
Mục tiêu:
Mục tiêu ngắn hạn: Nuôi cấy và nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu sao.
Mục tiêu dài hạn: Thu nhận những hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu sao nuôi
cấy in vitro và ứng dụng để tổng hợp thực phẩm chức năng.
Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế
bào đơn từ nhung hươu sao
Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế
bào đơn từ nhung hươu sao
Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên
Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

II

LỜI CẢM ƠN
Khi nhìn thấy những tế bào gốc nhung hươu đầu tiên phát triển trong điều kiện in

nhung hươu tăng sinh mạnh và chiếm khoảng 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy. Tiếp
đó, các tế bào nhung hươu được tiến hành cấy chuyền bằng Trypsin – EDTA 0,25%
nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho sự phát triển của chúng. Các tế bào
nhung hươu thu nhận được thể hiện tính đa năng giống tế bào gốc. Trong môi trường có
tác nhân biệt hóa thích hợp, các tế bào nhung hươu có khả năng biệt hóa thành tế bào
xương, tế bào mỡ…
INTRODUCTION
The annual regeneration of deer velvets is a unique developmental event in
mammals, which as a rule possess only a very limited capacity to regenerate lost
appendages. Some deer species, velvet regenerate rate achieves 2 cm/day. Thus, velvet
regeneration attract the scientists's attention very much. Researchers said that velvet
regeneration is a stem cell – based process. The cells derived from dapple deer velvet
have been collected and cultured with DMEM/F12 plus 10% FBS (fetal bovine serum).
About 10th day, those cells strongly expand and cover with 70 – 80% Roux’s surface. At
that time, the cells derived from dapple deer velvet are subcultured by using
trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development. The cells derived
from dapple deer velvet is multipotial like stem cells. They could be differentiated to
osteocytes in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate,
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

IV

ascorbate, acid ascorbic; to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-
methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

V

MỤC LỤC
BÁO CÁO NGHIỆM THU I

2.2. Dụng cụ và thiết bị 14
2.3. Hóa chất 15
2.4. Các phương pháp thực nghiệm 19
2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu 19
2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 20
2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn 21
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền 22
2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào 22
2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence
(phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) 23
2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của
tế bào gốc 23
2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 23
2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa 24
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu 28
3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 29
3.3. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu 31
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

VII

3.4. Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu 35
3.5. Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào thu nhận được từ mẫu mô nhung hươu
42
3.5.1. Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 42
3.5.2. Khả năng biệt hóa 42
3.5.2.1. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương 42
3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 14
2.3. Phần ngọn của nhung hươu 19
3.1. Phần ngọn của nhung hươu đã xử lý 28
3.2. Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 28
3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm
2
29
3.4. Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu (X100 30
3.5. Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy (X40) 32
3.6. Tế bào nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy (X40) 32
3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy (X40) 33
3.8. Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy (X40) 33
3.9. Tế bào nhung hươu sau 7 ngày nuôi cấy (X40) 34
3.10 Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy (X40) 34
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

X

3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ (X100) 36
3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ (X40) 36
3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 (cấy chuyền
lần 1) (X40)
37
3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền (X40) 37
3.15. Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền (X40) 38
3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền (X40) 38
3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền (X100) 39
3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa
(X40)
43

và cs [25]
49
3.27. Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40) 49
3.28. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương của
đề tài (A) so với tế bào AP (B) của Berg và cs [4]
50
3.29. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ của đề
tài (A, C) so với tế bào Stro – 1
+
(B, D) của Rolf và cs [25]
51
3.30. Tế bào nhung hươu của đề tài (A, B) , tế bào AP (C) và tế
bào Stro – 1
+
(D) sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ cho kết
quả dương tính với nhuộm Oil Red O
52

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhung hươu và ứng dụng của nó
1.1.1. Khái niệm
Nhung hươu là sừng non của con hươu. Thông thường, sừng chỉ hình thành ở
hươu đực. Hằng năm, vào cuối mùa hạ, sừng cũ rụng đi; mùa xuân năm sau sừng mới
sẽ mọc lại. Sừng hươu khi mới mọc rất mềm, mặt ngoài được bao phủ bởi một lớp lông
tơ màu nâu nhạt, trong chứa rất nhiều mạch máu. Vì sừng non mềm và sờ mịn như
nhung nên được gọi là nhung hươu.

được hình thành trên thân nhung.
Giai đoạn phân nhánh lần thứ ba: trên bướu thứ ba tạo thành rãnh nhỏ và tiếp
tục phân nhánh giống như giai đoạn phân nhánh lần thứ hai để tạo thành cặp sừng ba
nhánh.
Giai đoạn bong lớp da ngoài sừng: sau khi cặp sừng hươu có dạng ba nhánh, lớp
da có lông tơ bao bọc xung quanh sừng thoái hóa dần. Quá trình hóa sừng vẫn tiếp tục
diễn ra. Khi kết thúc quá trình hoá sừng, hươu bắt đầu cọ sừng vào cây, mô đất… làm
bong lớp da bao bọc bên ngoài. Cặp sừng mới này sẽ tồn tại cho đến mùa rụng sừng
năm sau.
1.1.3. Thành phần hóa học chính trong nhung hươu
Thông thường, thành phần hóa học của nhung hươu khô bao gồm 34% tro thô,
12% nước và 54% chất hữu cơ. Thành phần này có sự thay đổi tùy thuộc vào từng loài
hươu, độ tuổi của sừng, cũng như là vùng sừng (đỉnh, trên, giữa và gốc) được khảo sát.
Nhung hươu đang phát triển chứa nhiều loại tế bào khác nhau như nguyên bào sợi,
nguyên bào sụn, tế bào sụn, tế bào xương. Đỉnh của nhung hươu chứa các tế bào tiền
thân trung mô. Những tế bào này được chuyển đổi dần thành sụn. Sau đó, sụn sẽ
chuyển thành xương dưới tác động của testosterone. Sự vôi hóa này diễn ra một cách tự
nhiên trong suốt quá trình tạo sừng. Ngoài ra, nhung hươu còn chứa những hợp chất có
hoạt tính sinh học như collagen, glycosaminoglycan (GAG), polysacharide, các
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

3

hormon tăng trưởng (insulin – like growth factor – 1 & 2), prostaglandin. Đây đều là
những hợp chất quý, thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu.
1.1.4. Một số tác dụng dược lý của nhung hươu
Nhung hươu đã được dân gian sử dụng từ rất lâu. Trong Đông y, nhung hươu
được coi là vị thuốc bổ dùng trong các trường hợp mệt nhọc, thần kinh suy nhược, mụn
nhọt độc, làm điều hòa huyết mạch, chữa khớp xương bị sưng phù. Khoảng những năm
40 của thế kỷ XX, các nhà nghiên cứu phương Tây cũng bắt đầu công cuộc tìm hiểu

hươu, hay khả năng thực bào và hàm lượng globulin miễn dịch của chuột nhắt được
nâng cao khi tiêm pantocrin vào màng bụng.
1.1.4.4. Tác dụng làm giảm huyết áp
Theo những nghiên cứu đã công bố, các sản phẩm nhung hươu có tác dụng làm
giảm huyết áp. Tuy nhiên, mỗi sản phẩm lại có tác động khác nhau phụ thuộc vào quy
trình chế tạo ra sản phẩm đó. Nhưng nhìn chung, các nhà nghiên cứu đều đồng ý rằng
chính phức hợp cholin là tác nhân làm giảm huyết áp.
1.1.4.5. Tác dụng chống sốc
Theo kết quả nghiên cứu của Kang, sau khi bị đặt ở nhiệt độ khắc nghiệt và bị sốc
điện, chuột được cho ăn nhung hươu có thời gian hồi phục nhanh hơn so với con đối
chứng. Sự thoái biến của tuyến ức và chứng phì đại của tuyến thượng thận do tác động
của stress cũng được ngăn chặn nếu các đối tượng thí nghiệm được cho ăn nhung hươu.
Ngoài ra, nhung hươu còn có nhiều tác dụng về mặt sinh lý như kháng loét, kháng
nhiễm độc, giảm hàm lượng cholesterol, điều trị các bệnh viêm gan và thận, gia tăng
quá trình sản sinh hồng cầu, giảm sự phát triển của khối u, tăng tỉ lệ sống sót của đối
tượng ung thư, chống lại sự lão hóa…
1.2. Khái quát về tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa của cơ thể. Những tế bào này có khả
năng tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng riêng biệt.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

5

Khác với các loại tế bào khác của cơ thể, tất cả các tế bào gốc nói chung đều có hai đặc
điểm:
 Tự làm mới (self – renewal): có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ
phân bào mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.
 Tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): có khả năng biệt hóa thành bất
kỳ loại tế bào trưởng thành nào.
Tuy nhiên, trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với tế bào gốc toàn năng hoặc vạn

nhung hươu nuôi cấy in vitro. Trong khi đó, các nhân tố này cũng thể hiện chức năng
điều khiển sự phát triển in vivo của nhung hươu. Năm 2001, Allen S.P. và cộng sự tìm
thấy vai trò của retinoic acid đối với sự biệt hóa tế bào để hình thành xương trong quá
trình tái sinh của sừng hươu [1]. Các tác giả này cho rằng có ba receptor (α, β, γ) cho
cả RAR (retinoic acid receptor) và RXR (retinoid X receptor) được biểu hiện ở các
phần khác nhau trong quá trình phát triển của nhung, như trong sụn và phần đã hóa
xương. Năm 2003, khi nghiên cứu hoạt động phân bào trong nhung hươu đang phát
triển, Matich J. và các cộng sự thấy rằng hoạt động phân bào của các tế bào mỡ và
xương thường diễn ra ở vùng ngoại vi hơn là trung tâm của lõi xương. Trong khi đó, sự
phát triển của biểu bì hầu như chỉ xảy ra ở phần đỉnh. Và để phục vụ cho những nghiên
cứu này, Li C. và Suttie J.M. đã đưa ra các phương pháp thu nhận mô nhung hươu [20].
Theo đó, mô nhung hươu được chia làm ba phần chính: thân, mầm và trung tâm phát
triển. Mỗi phần trên được thu nhận theo một cách khác nhau.

Hình 1.1. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

7

(S – da – skin, P – màng sụn – perichondrium, B – xương xốp – spongy bone, C – sụn
chưa bị khoáng hóa – non – mineralised cartilage, MC – sụn đang bị khoáng)
Năm 2006, Clark D.E. và cộng sự nghiên cứu sự hình thành mạch trong quá trình
phát triển của nhung hươu. Với tốc độ tăng trưởng có thể đạt tới 2 cm mỗi ngày, việc
phát triển cùng lúc của các mạch trong thời gian này là một điều hết sức thú vị. Dựa
vào hình thái của các mạch được quan sát, các tác giả này cho rằng, sự hình thành
mạch là do sự kéo dài của các mạch đã có sẵn hay sự đâm chồi để phát sinh các bó
mạch nhỏ.
Tiếp theo, các nghiên cứu về mặt mô học của nhung hươu đã được tiến hành.
Năm 2003, Kierdorf U. và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu mô học của sự hình
thành xương trong sự phục hồi của cuống xương và giai đoạn sớm của sự tái sinh [15].

được hoàn toàn phù hợp với giả thuyết sự tái sinh sừng được xây dựng từ các tế bào
gốc hoặc tế bào tiền thân trung mô nằm ở lớp trong màng xương của sừng. Các tác giả
này cho rằng ổ tế bào gốc nằm ở lớp trong màng xương của sừng và sự tái sinh sừng
phụ thuộc vào sự hoạt động có tính chu kỳ của các tế bào gốc đó. Trong cuống sừng,
các tế bào STRO – 1+ cũng luôn nằm cạnh các sợi mô cơ (mô cơ xương trán). Trong
quá trình tái sinh sừng, các tế bào STRO – 1+ được tìm thấy trong nội mô mạch và
màng xương, trong mô dưới da của cuống và cả trong vùng sụn. Bên cạnh đó, nhuộm
hóa mô miễn dịch cũng thấy các tế bào dương tính với marker tế bào gốc CD271 cũng
nằm ở các vị trí tương tự trong sừng đang tái sinh. CD271, thụ thể nhân tố tăng trưởng
thần kinh ái lực yếu (LNGFR), là marker chung trong phân lập tế bào gốc trung mô
trực tiếp từ dịch tủy xương. Đến nay, chức năng của LNGFR trong tế bào tiền thân
trung mô vẫn chưa được làm rõ, nhưng nó có thể đóng vai trò đặc trưng hình thái trong
quá trình phát triển của khoang tủy xương người và các cơ quan khác. Nhuộm kép
STRO – 1 và CD271 cho thấy các tế bào trong màng xương sừng hươu có thể dương
tính với cả hai marker.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

9 Hình 1.2. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống [25]
(a) mẫu cuống (hình (b) và (c)) được cố định bằng Methylmetacrylate, nhuộm HE, E
(biểu mô), D (chân bì), SC (mô bề mặt dưới da – dấu hoa thị), Mf (phần mô cơ xương
trán), Fa (mô bị xé mỏng trong suốt quá trình mô học), CP (lớp trong màng xương), B
(xương cuống); (b) cuống trái và nhung nguyên phát của con đực hoang dại một năm
tuổi (Dama dama), sừng được cắt dưới khúc lồi để thu nhận cuống; (c) mặt cắt của
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

10


11

năng liên quan đến thiếu máu và việc ăn ngủ được cải thiện, đặc biệt là chưa phát hiện
tác dụng phụ.
Mặc dù ở nước ta nhung hươu đã được sử dụng từ lâu đời, và đây là nguồn tài
nguyên quý hiếm, nhưng cho đến nay việc nghiên cứu chuyên sâu tế bào nhung hươu
đặc biệt là tế bào gốc nhung hươu để hiểu rõ hơn về nhung hươu nhằm nâng cao khả
năng ứng dụng còn khả mới mẻ và chưa được quan tâm đúng mức.
1.4. Tính cấp thiết của đề tài
Khi chất lượng cuộc sống được nâng cao, nhu cầu về dinh dưỡng của con người
cũng thay đổi. Ngày nay, con người mong muốn thực phẩm không chỉ đảm bảo đủ
calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khỏe và
sắc đẹp. Bên cạnh đó, thực phẩm cũng được yêu cầu phải mang lại cho người sử dụng
khả năng miễn dịch cao, chống sự lão hóa, tăng tuổi thọ, giúp phòng ngừa được một số
bệnh, kể cả ung thư. Vì vậy, thực phẩm chức năng – loại thực phẩm bổ sung các hoạt
chất có tác dụng như là những vị thuốc quý, giúp con người bồi bổ sức khỏe, phòng
ngừa bệnh tật – ngày càng được quan tâm và sử dụng rộng rãi.
Nhung hươu là một vị thuốc quý, đã được dân gian sử dụng từ rất lâu đời. Các
hoạt chất thu nhận từ nhung hươu cho thấy một tiềm năng to lớn trong việc cải thiện và
bồi bổ sức khỏe. Vì vậy, nhung hươu được xem như là một nguyên liệu đầy hứa hẹn
dùng để chế biến thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, những nghiên cứu in vitro về thành
phần và công dụng của nhung hươu vẫn chưa được thực hiện nhiều. Ở Việt Nam, đây
là một lĩnh vực hoàn toàn mới. Vì vậy, sự thành công của đề tài đặc biệt rất có ý nghĩa
trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, nhung hươu chứa một loạt
những hoạt chất sinh học quý như: proteoglycan, parathyroid hormone – related
peptide (PTHrP), glycosaminoglycan, collagen, hormone tăng trưởng, nhân tố tăng
trưởng, chất chống oxi hóa… Đặc biệt, năm 2008, Hans J. Rolf và cộng sự tại trường
đại học Goettingen (Đức) đã thu nhận thành công các tế bào giống tế bào gốc từ nhung


Mô nhung hươu tươi
Đông lạnh
Giải đông
Thu nhận tế bào đơn
Xác định tính gốc
của tế bào nhung hươu
1. Thu nhận tế bào đơn
2. Nuôi sơ cấp
3. Cấy chuyền tăng sinh
Phân tích
dựa trên