HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA THÚ Y
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN
Người thực hiện : HỒ THỊ THANH LOAN
Lớp : TYC – K55
HÀ NỘI, 2014
2
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA THÚ Y
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN
Người thực hiện : HỒ THỊ THANH LOAN
Lớp : TYC – K55
Người hướng dẫn : 1. TS. PHẠM HỒNG NGÂN
2. Th.S CAM THỊ THU HÀ
Địa điểm thực tập : Phòng thí nghiệm Bộ môn Thú
y Cộng Đồng, Khoa Thú Y, Học
Viện Nông Nghiệp Việt Nam
HÀ NỘI, 2014
4
LỜI CẢM ƠN
Thời gian được học tập và rèn luyện dưới mái trường Học Viện Nông Nghiệp
Việt Nam đã giúp tôi có những hành trang để mình bước những bước chân đầu tiên
vào trường đời. Tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình, sự quan tâm của các Thầy giáo,
Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô khoa Thú y đã truyền đạt các kiến thức chuyên môn
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện 3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái 4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy 4
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa 5
2.1.6. Cấu trúc kháng nguyên 6
2.1.7. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh 7
2.1.8. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 8
2.1.9. Độc tính của Bacillus subtilis 11
2.1.10. Một số nghiên cứu ứng dụng của Bacillus subtilis 12
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BẢO TỒN, LƯU GIỮ GIỐNG VI KHUẨN TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 16
2.3. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ BẢO TỒN, LƯU GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 21
2.3.1. Định nghĩa về bảo tồn 21
2.3.2. Bảo tồn, lưu giữ giống Bacillus subtilis bằng hai phương pháp lạnh đông và đông khô 23
2.3.3. Vai trò, ý nghĩa của bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn 27
ii
PHẦN III 27
NỘI DUNG – NGUYÊN VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. NỘI DUNG 27
3.1.1. Đánh giá sự ổn định về số lượng và mức độ an toàn của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời
gian bảo tồn 28
3.1.2. Đánh giá sự ổn định về đặc tính nuôi cấy và một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis sau
thời gian bảo tồn 28
3.1.3. Bảo tồn và lưu giữ nguồn genBacillus subtilis 28
3.2. NGUYÊN LIỆU 28
3.2.1. Môi trường, hóa chất 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis 6
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 10
Bảng 2.3. Cách bảo quản giống trên môi trường gelatin 25
Bảng 4.1. Số lượng của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 35
Bảng 4.2. Kết quả ô nhiễm nấm trong vi khuẩn Bacillus subtilis sau bảo tồn 36
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn Bacillus subtilis
sau thời gian bảo tồn 38
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis sau thời
gian bảo tồn 39
Bảng 4.5. Tỷ lệ sống của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi đông khô 46
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 3
Hình 2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường nước thịt 5
Hình 2.3. Quá trình tạo bào tử 8
Hình 2.4. Cấu tạo của bào tử 9
Hình 4.1 Bacillus subtilis trên môi trường thạch nghiêng TSA 40
Hình 4.2. Hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis 41
Hình 4.3. Bacillus subtilis trên môi trường thạch TSA 41
Hình 4.4. Bacillus subtilis trên môi trường thạch khoai tây 42
Hình 4.5. Bacillus subtilis trên môi trường TSI 43
Hình 4.6. Bacillus subtilis trên môi trường nước thịt 43
Hình 4.7. Phản ứng Indol của Bacillus subtilis 44
Hình 4.8. Phản ứng MR của vi khuẩn Bacillus subtilis 44
Hình 4.9. Phản ứng catalase của vi khuẩn Bacillus subtilis 45
Hình 4.10. Các ống đông khô vi khuẩn Bacillus subtilis 47
Hình 4.11. Các ống vi khuẩn Bacillus subtilis lạnh sâu 47
đã và đang được quan tâm do chúng có thể phục vụ cho công tác nghiên cứu,
ứng dụng trong sinh học và công nghệ sinh học để tạo ra các sản phẩm đa dạng
phục vụ cho đời sống.
Bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn là bảo tồn các vi khuẩn sống hoàn chỉnh
hay bộ phận sống của chúng mang thông tin di truyền sinh học có khả năng tạo
ra hay tham gia tạo giống mới của vi khuẩn nhằm phục vụ các công nghệ sinh
học sản xuất các sản phẩm của giống được bảo quản. Bảo quản và lưu giữ giống
vi khuẩn ở trạng thái sống, thuần khiết và ổn định là việc làm khó khăn vì các
chủng vi khuẩn có đặc điểm sinh học riêng và các đặc điểm này có thể thay đổi
theo thời gian bảo quản do sự mất dòng tế bào hay sự xâm nhiễm của các vi sinh
vật. Vì vậy việc lưu giữ ổn định và bảo tồn tất cả các đặc tính sinh học của vi
khuẩn trong suốt thời gian lưu giữ là cực kỳ quan trọng.
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, của các công trình nghiên cứu, thì
hiện nay, ngoài những phương pháp bảo tồn vi khuẩn đơn giản như cấy truyền,
1
bảo tồn trong cát…thì đã có các phương pháp bảo tồn đạt hiệu quả tối ưu hơn.
Nhờ khoa học, nhờ nghiên cứu, hai phương pháp bảo tồn, lưu giữ giống vi
khuẩn là lạnh đông (lạnh sâu) và đông khô đang được sử dụng ngày càng phổ
biến, mang lại hiệu quả cho công tác bảo tồn phục vụ hữu ích cho công việc
nghiên cứu.
Bacillus subtilis là một vi khuẩn được nhắc đến nhiều, được đề cập nhiều
trong các công trình nghiên cứu. Đặt ra một vấn đề cho chúng ta là lưu giữ, bảo
tồn giống vi khuẩn này phục vụ cho công tác nghiên cứu được thuận tiện hơn.
Để đánh giá được mức độ ổn định của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian
bảo tổn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự ổn
định của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn”.
1.2. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI
- Kiểm tra được mức độ ổn định về số lượng, đặc điểm nuôi cấy, đặc tính
sinh hóa, khả năng sinh bào tử của Bacillus subtilis.
- Hệ thống hóa các thông tin dữ liệu của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
Thị Thứ, 1996).
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram (+), kích thước 0,5-
0,8 µm x 1,5-1,3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng
di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và
nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy
mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,
tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000).
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
o
C
Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả
năng phát triển trong môi trường thiếu oxy
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0- 7,4
Môi trường:
- Môi trường thạch đĩa TSA: Khuẩn lạc dạng tròn,rìa răng cưa không
đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3-5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt
nhăn nheo màu hơi nâu.
- Môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu xám nhạt,rìa
nhăn gợn sóng, xù xì, bề mặt khô.
- Môi trường gelatin: Phát triển và làm tan chảy gelatin, có những mảng
lớn màu trắng, khi lắc khó tan, không làm vẩn đục môi trường.
4
- Thạch khoai tây: Phát triểu đều, màu vàng lấm tấm hạt, khi cấy theo
đường ziczac thì khuẩn lạc mọc lan rộng ra khỏi đường cấy tạo thành hình cành
cây khô.
- Môi trường nước thịt: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường,
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
(Holt, 1994; TríchLý Kim Hữu, 2005)
2.1.6. Cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D
và L-acid glutamic. Ngoài ra, Bacillus subtilis có khả năng sản sinh kháng sinh
subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+) và Gram (-).
6
2.1.7. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây
bệnh
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng
chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột. Chúng còn
có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
Với các vi sinh vật gây bệnh
Môi trường nuôi cấy mầm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với
một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian
sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử
dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng
1. Hình thành vách ngăn
2. Sự tạo tiền bào tử
3. Tạo lớp vỏ bào tử
4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử
5. Sự giải phóng bào tử
Hình 2.3. Quá trình tạo bào tử
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc
8
và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡngphân giải và bào tử được giải
phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị
trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành
tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương,
2004).
Cấu tạo của bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học
cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỷ lệ giữa các
thành phần và có thêm một số thành phần mới. Phía ngoài của nguyên sinh chất
được bao bọc bởi nhiều lớp màng.
Hình 2.4. Cấu tạo của bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước,
cấu tạo chủ yếu là lipoprotein.
Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có cấu trúc nhiều lớp, bề mặt của các lớp
này xù xì, thành phần hóa học là protein và có sự tham gia của keratin, đây là
những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan
trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều
kiện bất lợi.
9
Sở dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:
10
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả
năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca
+
và acid dipicolinic, protein của bào
tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao
đối với nhiệt độ.
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại
dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào
bên ngoài.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp
màng làm cho các chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
2.1.9. Độc tính của Bacillus subtilis
Đối với con người
Một số chủng Bacillus subtilis cũng như những họ hàng gần của nó là B.
licheniformis, B. pumulis, B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một
enzyme có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, vẫn chưa
có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người.
Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trường
hợp ngộ độc thực phầm.
Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có
độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối
với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm
đường hô hấp…
Bacillus subtilis có độc tính rất thấp đối với người vì nó sản xuất ra enzyme
ngoại bào và các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người. Ngoại
trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miến dịch
của người đang quá suy yếu. Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện
Trong nông nghiệp
12
Copyright: Tài liệu đại học ©