Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
MỤC LỤC
A. MỞ ĐẦU ............................................... Error: Reference source not found
B. NỘI DUNG ........................................... Error: Reference source not found
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen ... Error: Reference
source not found
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen ....... Error: Reference source not
found
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật . Error: Reference source
not found
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp Error: Reference source not
found
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens ..... Error:
Reference source not found
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus ...... Error: Reference source not
found
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp Error: Reference source not
found
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) ...... Error: Reference
source not found
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) . Error: Reference
source not found
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) ........ Error: Reference
source not found
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm ... Error: Reference source not
found
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học Error: Reference source
not found
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) .............. Error:
Reference source not found
4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen Error: Reference source

khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện
được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai
xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần
cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và
Thủy Hồng
2
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài
có họ hàng gần nhau.
Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển
gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng
chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua,
cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh
vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất
những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật
chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng
những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được
giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống
truyền thống.
Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn
ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế
bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế
bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu,
gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của
những cơ thể chuyển gen.
Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt
như sau:
- Tăng sản lượng

vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu
được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.
Thủy Hồng
4
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo
ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con
người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự
nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ
sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt
quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao
của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.
B. NỘI DUNG
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý
một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập
của một gen ngoại lai
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và
khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome
Thủy Hồng
5
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau.
Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp
và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế
bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác
hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen,

Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện
genomic ADN)
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp
- Biến nạp vào E. coli
- Tách chiết ADN plasmid
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương
pháp khác nhau đã kể trên
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc
- Tái sinh cây biến nạp
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot)
và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot,
ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...)
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ,
các mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và
dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần
tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những
enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo
Thủy Hồng
7
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo
thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn
chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern
blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi
gen.
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật

thành phần: T- DNA và vùng Vir.
T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính
nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T-
DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp
các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì
đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật.
Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải.
Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA
đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Thủy Hồng
10
Bộ gen của
vi khuẩn
Ti plasmid
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều
hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất
diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối
cùng gắn gen cần biến nạp.
* Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen
thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể.
- Vector liên hợp (Cointegrated vector)
Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên
hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc
từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc
trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế
bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang
trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ
lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng
cho chuyển gen vào thực vật.

bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái
tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm...)
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector
chuyển gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ
xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể
mang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên,
virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau:
- Hệ gen của virus phải là ADN
- Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các
lỗ ở vách tế bào
Thủy Hồng
12
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
- Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen
này vào tế bào thực vật
- Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)
- Không gây tác hại đáng kể cho thực vật
Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng
làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử
dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó
ghép nối với hệ gen của thực vật.
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Hình 3. Súng bắn gen
* Nguyên lý
Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích
thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn
ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp
xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời
gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho
ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta
chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần
chuyển vào thực vật.
Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong
khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất
hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ
gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau
quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo
là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen.
* Đối với protoplast phương pháp xung điện đã có kết quả khích lệ
nhưng chưa chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy
protoplast ở một số loài cây vẫn còn gặp khó khăn.
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Thủy Hồng
15