VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐOÁN
NHẰM HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ PHÒNG NGỪA NHIỄM VI SINH VẬT
Ở CÁC BỆNH NHÂN BỊ CÁC BỆNH DẠ DÀY
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN HELICOBACTER PYLORI CNĐT: NGUYỄN THỊ NGUYỆT 9783


nghệ Sinh học và các Thành viên của Hội đồng nghiệm thu các cấp Cơ sở & Nhà
nước, đặc biệt là GS Tạ Long đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng tôi thực
hiện nhiệm vụ.
Hà Nội tháng 8 năm 2012

Sunday, September 01, 2013
2

Hà Nội, ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP
TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ
ĐỊNH THƯ VIỆT-MỸ TỪ THÁNG 1/2010 ĐẾN THÁNG 6/2012 I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài/dự án: “Nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán nhằm hỗ trợ điều trị,
phòng ngừa nhiễm vi sinh vật ở các bệnh nhân bị các bệnh dạ dày liên quan đến
Helicobacter pylori”.
Thuộc: Nghị định thư với nước Hoa Kỳ
- Chương trình (tên, mã số chương trình): 50 /2010/HĐ-NĐT
- Dự án khoa học và công nghệ (tên dự án): Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa họ
c và
công nghệ theo Nghị định thư - Khoá họp ngày 26 tháng 2 năm 2008 tại Washington.
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án
- Họ và tên : Nguyễn Thị Nguyệt
- Ngày, tháng, năm sinh : 06/02/1977 Nam/ Nữ: Nữ.
- Học hàm, học vị: Tiến sĩ
- Chức vụ: Nghiên cứu viên
- Điện thoại : Tổ chức: 84-4-8344691 Nhà riêng: 38373578 Mobile: 0942783559
- Fax: 88363144
- E-mail: nguyetnt6897@ yahoo.com
-Tên tổ chức đang công tác:Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ


Theo kế hoạch
Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị quyết
toán)
1 1-12/ 2010 1000 1-12/2010 1000 1000
2 1-12/2011 450 1-12/2011 450 450
3 1-6/2012 350 1-6/2012 350 350

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Đối với đề tài
Theo kế hoạch Thực tế đạt được Số
TT

Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn

Tên văn bản
1 168/QĐ-KHCNVN
09/02/2010
Quyết định giao chỉ tiêu kế hoạch năm 2010

2

2615/QĐ-BKHCN
18/11/2009

Quyết định phê duyệt danh mục và kinh phí các
nhiệm vụ hợp tác Quốc tế về Khoa học và Công
nghệ theo nghị định thư bắt đầu thực hiện năm
2010.

3

340/QĐ-CNSH
28/6/2012

Quyết định thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp
cơ sở Quy trình sản xuất Kít.

4

341/QĐ-CNSH
28/6/2012

Quyết định thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp
cơ sở nhiệm vụ nghị định thư.

1.Lựa chọn 589 bệnh
nhân và lấy bệnh phẩm
dạ dày.
3. Xác định tỷ lệ nhiễm
H. pylori của ba nhóm
bệnh .

2 Đại học Y
Hà Nội Đại học
Y Hà Nội 1.Nghiên cứu các tổn
thương dạ dày.
2.Xác định sự hiện diện
của H. pylori, nấm, vi
khuẩn non-HP trong sinh
thiết dạ dày.
3. Xác định tỷ lệ nhiễm vi
sinh vật


CagA/VacA .
6.Phân lập H. pylori và
non-HP & định tên và xác
định tỷ lệ nhiễm
7.Xác định tên của 10 loài
nấm dạ dày
8.Thiết kế 02 cặp mồi và
02 m
ẫu dò huỳnh quang
cho H. pylori và C. krusei
9.Thiết kế bộ chế phẩm
sinh học học chẩn đoán
nhiễm vi sinh vật dạ dày.
10.Thiết kế mẫu mã Bộ
sinh phẩm phát hiện bội
nhiễm vi sinh vật dạ dày.
11.Sản xuất thử 010 Bộ
sinh phẩm.
12. Nghiên cứu các điều
kiện sử dụng và bảo quản.
13.Thử nghiệm Bộ sinh
phẩm trên 200 mẫu sinh
phẩm.
14. Đề nghị các biện pháp
đề phòng và điều trị các vi
sinh vật gây nhiễm dạ
dày.
15.Viết tổng kết các kết
qủa nghiên cứu của nhiệm
vụ nghị định thư,

10. Chọn một mẫu mã.
11.Đã sản xuất 10 bộ .
12. Xác định điều kiện
sử dụng và b
ảo quản.
13.Đã thử nghiêm trên
250 mẫu bệnh.
14. Đề nghị biện pháp
đề phòng và điều trị
nhiễm vi sinh vật dạ
dày
15.Hoàn thành bản
tổng kết tổng hợp.
16. Một bài báo tiếng
Anh, bốn bài tiếng Việt
17. 02 Tiến sĩ.
- Nguyễn Văn Thịnh
- Nguyễn Thị Nguyệt
7
3.Phân lập, định tên một
số chủng non-HP t
ừ 89
mẫu bệnh phẩm dạ dày
chẩy máu.
4.Xác định các loài nấm
gây nhiễm dạ dày bằng
mẫu dò Beacon
5.Bàn bạc số liệu viết báo
tiếng Anh

1.27 chủng H. pylori từ
89 mẫu bệnh phẩm
trong nghiên cứu 2
2.Các số liệu về tính
trạng di truyền cagA và
vacA của các chủng H.
pylori đang lưu hành ở
Việt Nam
3.Phân lập và định tên
119 chủng non-HP từ
89 mẫu bệ
nh phẩm dạ
dày chẩy máu
4. Phát hiện sự dịch
chuỷển từ nhiễm nấm
C. albican, sang nhiễm
nấm C. krusei .
5.Một bài báo tiếng
Anh đang xem xét, 01


Viện
Quân Y
Trung
ương 108

1. Phân lập các chủng H.
pylori từ các bệnh nhân bị
loét tá tràng và xác định
các đột biến gây kháng
Clarithromycin
2. Bàn bạc số liệu và cùng
viết báo.

1. Phân lập các chủng
H. pylori .
2. Giải trình tự gen 23S
rARN gây kháng thuốc
của 29 chủng H. pylori
3. Viết 01 bài báo

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án

Số
TT
Tên cá
nhân đã
Tên cá
nhân đã
Nội dung tham gia chính

7. Sản xuất thử các Bộ sinh
phẩm
8.Nghiên cứu các điều kiện
sử dụng và bảo quản Bộ
sinh phẩm
9.Thử nghiệm Bộ sinh
phẩm trên 200 mẫu sinh
phẩm.
10. Tham gia viết tổng kết
11. Tham gia viết báo tiếng
Việt

1. Hoàn thành
2.Chọn được 589 bệnh
nhân và lấy 589 bệnh
phẩm
3.Tỷ lệ nhiễm H. pylori
ở ba nhóm bệnh
4.Các số liệu về tính
trạng gây bệnh cagA
và vacA của các chủng
H. pylori đang lưu
hành
5.Phân lập 27 chủng
HP, 119 chủng non-HP
và định tên & tỷ lệ
nhiễm
6.Xác định tên của 11
loại nấm
7. Mười bộ sinh phẩm


1.Hoàn thành
2.Hoàn thành .
3.Các kết quả nghiên
9

truyền gây bệnh CagA,
VacA của các chủng H.
pylori đang lưu hành
4.Phân lập một số chủng H.
pylori và non-HP & xác
định tỷ lệ nhiễm
5.Xác định tên của 10 loài
nấm dạ dày
6.Thiết kế các cặp mồi và
mẫu dò huỳnh quang MB
cho H. pylori và C. krusei
7.Thiết kế Kit chẩn đoán
bội nhiễm vi sinh vật dạ
dày
8.Thiết kế mẫu mã Bộ sinh
phẩm
9.Sản xuất thử các B
ộ sinh
phẩm
10.Nghiên cứu điều kiện sử
dụng và bảo quản Bộ sinh
phẩm
11.Thử nghiệm Bộ sinh
phẩm trên 200 mẫu sinh

nghiêm trên
250 mẫu sinh phẩm
12.Đề nghị biện pháp
đề phòng & điều trị
nhiễm vi sinh vật dạ
dày
13.Bản tổng kết tổng
hợp
14. Một bài báo tiếng
Anh, 04 bài báo tiếng
Việt đã đăng,
15. Hai tiến sĩ bảo vệ
năm 2010 và 2011.

3

Dương
Thu
Hương.

Dương Thu
Hương.

1.Nghiên cứu tính trạng di
truyền gây bệnh CagA,
VacA của các chủng H.
pylori lưu hành.
2.Phân lập một số chủng H.
pylori và non-HP & xác
định tỷ lệ nhiễm.

loại nấm dạ dày.
4.Các điều kiện sử
dụng và bảo quản bộ
sinh phẩm.
5. Kết quả th
ử nghiêm
trên 250 mẫu sinh
phẩm.
6. Bản tổng kết.
7.Một bài tiếng Anh
đang được xem xét, 02
bài báo tiếng Việt đã
đăng, 01 bài đã được
đăng trong Proceeding
Hội nghị Quốc tế về
Tiêu hóa Đông Nam Á
lần 9 năm 2012.

4

Nguyễn
Văn
Thịnh Nguyễn
Văn Thịnh 1.Khám nội soi và lựa chọn

mô bệnh học .

6

Nguyễn
Thanh
Thuỷ

Nguyễn
Thanh
Thuỷ

Nghiên cứu hình dạng của
một số chủng vi khuẩn non-
HP bằng kính hiển vi điện
tử SEM. Xác định hình dạng
của các chủng vi khuẩn
non-HP.dưới SEM

7

Guillerm
IPP

Guillermo
IPP


Glm, IR củ
a H. pylori.
4.Tham gia xác định C.
krusei trong sinh thiết
dạ dày.
5.Cùng viết báo cáo
nghiên cứu và một bài
báo đang được xem
xét.

8 1.David S.
Perlin
2,Yanan Z

1.Thiết kế mẫu dò Beacon
và các điều kiện phân tích.
2.Xác định các vi sinh vật
gây bệnh bằng kỹ thuật
Beacon.
3.Cùng bàn luận viết bài
báo tiếng Anh


01 bài báo tiếng Việt . 6.
Tình hình hợp tác quốc tế

Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,
số lượng người tham gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên
tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người
tham gia )

1

Học phương pháp lấy bệnh phẩm
dạ dày trên bệnh nhân trong 15

Hoàn thành khóa học.

12

ngày, từ 30/5 đến 15/5/2011 tại
Đại học Tổng hợp New York. 1
đoàn, 1 người.

Hội nghị, hội thảo kỷ niệm hợp tác
quốc tế Việt Mỹ, tháng 3/201.

Poster tại Bộ khoa học và
Công nghệ.
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu

Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc
- tháng … năm)
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Người, cơ quan
thực hiện
13 Các nội dung, công việc thực
hiện chủ yếu.
8 / 2009
1 / 2010
8 / 2009

13

H. pylori phân lập từ các bệnh
nhân thuộc ba nhóm bệnh.
5
Phân lập các vi khuẩn gây
nhiễm ở điều kiện kị khí và xác
định tỷ lệ nhiễm.
8/2010
6/2011

8/2010
6/2011

1.Bệnh viện Bưu
Điện.
2.Đại học Y Hà
Nội.
6
Nghiên cứu xác định các tổn
thương dạ dày và sự hiện diện
của các vi sinh vật (H. pylori,
nấm, vi khuẩn khác) trong sinh
thiết dạ dày bằng phương pháp
mô bệnh học.
1-12/2011 1-12/2011 Viện CNSH.
7
Xác định tỷ lệ nhiễm nấm ở
các nhân bệnh nhân.
6-12/2011 6-12/2011 1.Viện CNSH.

12
Thiết kế mẫu mã Bộ sinh
phẩm.
2-5/2012 2-5/2012 Viện CNSH.
13
Nghiên cứu điều kiện sử dụng
và bảo quản Bộ sinh phẩm.
1- 4/2012 1-4/2012 Viện CNSH.

14
Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên
200 mẫu sinh phẩm để xác
định độ nhạy .
3-4/2012 3-4/2012 Viện CNSH. 15
Xem xét các biện pháp đề
phòng và điều trị các vi sinh
vật gây nhiễm dạ dày.
1/2010-
5/2012
1/2010-
5/2012
Viện CNSH.
16
Viết các chuyên đề. 5-6/2012 5-6/2012 Viện CNSH.
14

17

2

Báo cáo phân tích hiệu quả của bộ
sinh phẩm chẩn đoán sử dụng mẫu dò
Beacon.

1

1

1

1

3

Đề xuất một số phương pháp điều trị
các bệnh dạ dày do nhiễm vi sinh vật
dạ dày và đề nghị cách thức phòng
ngừa.

1

1

1

1
- Lý do thay đổi (nếu có): Không

- 05 bài báo
-Tạp chí khoa học tiêu
hóa Việt Nam V(19):
1265-1272 (2010).
- Tạp chí Y học thực hành
712 ( 4): 20-22 (2010).
-Tạp chí Y dược lâm sàng
8 (3) 669:14-23 (2011).
15
-01 bài báo nước

Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết thúc)
1 Tiến sĩ
01 02 1.Tiến sĩ Nguyễn Văn Thịnh,
Bệnh viện Bưu Điện (2010)
2.Tiến sĩ Nguyễn Thị Nguyệt,
Viện CNSH (2011).
3.Cử nhân Dương Thu
Hương, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Hà Nội (2010).

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây
trồng
Kết quả
Số TT Tên sản phẩm đăng ký
Theo
kế hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)
1

TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ
trì…)

I Báo cáo định kỳ
Lần 1

15/01/2011
Hoàn thành xuất sắc nhiệm vụ đăng ký
trong năm 2010.

Lần 2
Báo cáo
định kỳ 6
tháng
Hoàn thành nhiệm vụ các năm tiếp theo và
thực hiện nhiệm vụ của Đoàn ra 2010 và
2011.
II Kiểm tra định kỳ
Lần 1+2 (kết hợp
cả 2 lần kiểm tra)
25/3/2012 Tiến độ triển khai của Nhiệm vụ cho đến
thời điểm kiểm tra cơ bản là đạt yêu cầu.
Cụ thể:
- Thu thập 589 mẫu bệnh phẩm .
- Phân lập được 119 chủng vi sinh vật từ

(Họ tên, chữ ký) Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu) TS. Nguyễn Thị Nguyệt PGS.TS. Trần Đình Mấn 18


a. Hiện tượng phát triển vượt trội của các vi sinh vật trong dạ dày.
b.Các hợp chất Nitroso.
37
Tình hình nghiên cứu nhiễm vi sinh vật dạ dày ở Việt Nam
38
Các nguyên nhân dẫn đến nhiễm vi sinh vật của dạ dày
39
Phát hiện nhiễm vi sinh vật dạ dày
10
Mẫu dò Beacon và ứng dụng trong qPCR
a.Phát minh mẫu dò Beacon.
b.Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của một mẫu dò Beacon.
c. Ứng dụng của các mẫu dò Beacon.
41
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
43
Sơ đồ nghiên cứu
a.Nghiên cứu tình trạng nhiễm H. pylori và nhiễm vi sinh vật dạ dày
ở các bệnh nhân bị viêm, loét và ung thư dạ dày.
b.Nghiên cứu chế tạo Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm vi sinh vật,
dạ dày, sử dụng đầu dò dựa trên công nghệ Beacon,

44
Đối tượng nghiên cứu
a. Bệnh nhân.
b. Bệnh phẩm

44
Thiết bị máy móc và hóa chất nghiên cứu
45

- Nghiên cứu bảo quản Bộ sinh phẩm
46
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
54
Lựa chọn bệnh nhân theo các nhóm bệnh
55
Nghiên cứu 1 (trên 500 bệnh nhân)
55
Nhiễm H. pylori
a.Tỷ lệ nhiễm H. pylori trong các nhóm bệnh nhân.
b.Khảo sát kiểu gen CagA và VacA của các chủng H. pylori
55
Nhiễm vi khuẩn non-HP
a. Phân lập các chủng non-HP
b.Hình dạng các chủng non-HP dưới kính hiển vi thường và SEM.
c. Định tên các chủng vi khuẩn non-HP.
d. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn non-HP.
e.Một số điểm sinh học của các chủng vi khuẩn non-HP.
56
Nhiễm nấm
65
20

a. Phát hiện nấm trong dạ dày.
b. Xác định tỷ lệ nhiễm nấm trong dạ dày.
c. Xác định tên của một số loại nấm dạ dày

Nghiên cứu 2 ( trên 89 bệnh nhân)
a.Một số đặc điểm sinh học của các bệnh nhân
b.Nghiên cứu điều kiên nuôi cấy và phân lập các chủng H. pylori

- Xác định độ nhậy lý thuyết Se và đặc thù Sp của phản ứng qPCR.
-Thiết kế điều kiện phản ứng qPCR phát hiện C. krusei.
c. Đường chuẩn qPCR.
91
Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm phát hiện nhiễm vi sinh vật dạ dày
a.Chuẩn bị các dung dịch gốc cho Bộ sinh phẩm.
b.Chuẩn bị các dung dịch của Bộ sinh phẩm.
c.Thành phần Bộ sinh phẩm.
96
21

d.Hướng dẫn sử dụng Bộ sinh phẩm.
Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 250 mẫu bệnh phẩm
a. Xác định Cadida krusei trong 125 mẫu bệnh phẩm .
b. Xác định H. pylori trong 125 mẫu bệnh phẩm.

101
Phân tích hiệu quả của Bộ sinh phẩm
105
KẾT LUẬN
106
TÀI LIỆU THAM KHẢO
107
PHỤ LỤCI
-Qui trình sản xuất Kit chẩn đoán bội nhiễm vi sinh vật dạ dày sử dụng công
nghệ Beacon
-Phân tích hiệu quả của Bộ sinh phẩm
-Các đề xuất
PHỤ LỤCI
- Biên bản ghi nhớ hợp tác nghiên cứu giữa Việt Nam và Mỹ


Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt
H. pylori Helicobacter pylori
Vi khuẩn dạ dày
16SrARN
16S ribsomal ARN
16S rARN
ADN Deoxyribonucleic Acid Acid deoxyribonucleic
RNA Ribonucleic Acid Acid ribonucleic
BB Bruccela Broth Môi trường nuôi H. pylori
bp base pair Cặp bazơ
VacA Vacuolating cytotoxin Antigen Độc tố tạo không bào
DSR, LS

Dị sản ruột, Loạn sản
EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid Ethylen diamin tetraacetic acid
EtBr Ethidium bromide Thuốc nhuộm ADN
HP1125 HP1125 membrane protein Protein màng HP1125
HTT Duodenal Hành tá tràng
IACR International Agency
for Research of Cancer
Tổ chức nghiên cứu ung thư
quốc tế
IL-2, IL-8 Interleukin -2, Interleukin - 8 Interleukin- 2, Interleukin- 8
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
MBH Histology Mô bệnh học
NMDD Gastric mucose Niêm mạc dạ
dày
NoHPA Non Helicobacter pylori Agar Non-H. pylori agar
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi

Thị Hồng Hạnh và cs).
Hình 6. Western đồ trên huyết thanh củ
a các bệnh nhân nhiễm H. pylori.
Hình 7. Tính đa hình của H. pylori trong các quần thể dân cư địa lý.
Hình 8. Hai dạng sinh học của Canadida albican: dạng tế bào sợi (8a) và dạng tế bào
giống nấm men (8b).
Hình 9. Phát hiện các loài nấm gây bệnh bằng kỹ thuật ADN microarray.
Hình 10. Phân lập các vi khuẩn non-HP và nấm Candida từ các bệnh nhân bị viêm dạ
dày mãn tính.
Hình 11.Hệ thống phân tích Heidelberg xác định chính xác tình trạng giảm tiết HCl
của dạ dày.
Hình 12.
Mô hình cổ điển của một mẫu dò MB do Fred Kramer và đồng nghiệp thiết
kế 20 năm trước đây (1) Chất phát tín hiệu huỳnh quang Fluorophore (2) Chất làm tắt
tín hiệu huỳnh quang quencher.
Hình 13. Mẫu dò Beacon phát tín hiệu huỳnh quang khi chuyển từ cấu trúc đóng (1)
sang cấu trúc (2) gắn với đoạn ADN đích.
Hình14. Phát hiện các đột biến trên gen rpoB gây kháng rifampin của M. tuberculosis
bằng các mẫu dò MB.
Hình 15. Phát hiện H. pylori bằng Helicotest.
Hình 16. C
ấu tạo của các mẫu dò MB phát hiện H. pylori và C.krusei.
Hình 17. Các chủng vi khuẩn non-HP trên đĩa thạch TSA.
Hình 18. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn và nấm phân lập từ các bệnh nhân viêm
chẩy máu dạ dày dưới kính hiển vi Olympia, độ phóng đại x 100.
Hình 19. Hình ảnh của một số vi khuẩn non-HP dưới kính hiển vi điện tử SEM.
Hình 20. Nhiều loại vi khuẩn non-HP phân lập từ dạ dày người b
ệnh có họat tinh
Hemolysin.
H×nh 21. Phát hiện nấm trong dạ dày bằng phương pháp PCR khuyếch đại vùng ITSII

Trích đoạn 1(19CB) 2(1AB) 3(1CB) 4(3AB) 5(3CB) 6(3AG) 7(3GC) 8(4AG) 9(4CG) 10(5AB) 11(5CB) 12(7AB) 13(7CB) 14(8CB) 15(4AB) 16(17AB) 17(19AB) 18(21AB) 19(23AB) 20(24AB) AAACATTAAA AATAAGACTTTAATTTTCAA TATTTTATGA AAACAAAGCC TTAATTCCAT 60 TAATAACTAT GATAATGTTT TGAATTTTTA TTTTTAAGAT ATTTTCAAGG TATCTTTAAT Thân v n=10 H v n=10

---