1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay trong lĩnh vực chăn nuôi, một thành tựu đánh dấu sự tiến bộ vượt bậc
của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục là khả năng tạo được hợp tử bên ngoài cơ thể mẹ
thông qua sự kết hợp tinh trùng và noãn trong điều kiện in vitro. Ở động vật, nguồn
phôi dồi dào có thể phục vụ cho các mục đích khác nhau như: tạo động vật chuyển
gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân bản động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí
nghiệm tương đương nhau phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì,
cũng cần phải qua khâu tạo nguồn noãn chín đồng loạt. Đó là bước căn bản trong thao
tác liên quan đến khoa học về sinh sản.
Ngày 24/04/2005, các nhà khoa học của đại học quốc gia Seoul đã thành công
khi cho sinh sản vô tính một giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ra ngày
05/08/2005). Trên thế giới, công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói chung và
việc tạo noãn chín in vitro nói riêng rất phổ biến, nhưng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn
hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và
nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất
dài và tỉ lệ nuôi thành công rất thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa.
Vì những lý do trên, đề tài “Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo
và chó” được tiến hành.

1.2. Mục tiêu và yêu cầu
Mục tiêu
Góp phần xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam.

Yêu cầu
Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó.
Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó.
Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực của noãn chín.


Nang noãn thành thục thì tế bào hạt trong biểu mô tiết ra nhiều estrogen.
Estrogen làm gia súc biểu hiện động dục. Estrogen gồm estradiol và sản phẩm
hóa học của nó là estrol và estriol. Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ
3
cấp của gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung và ống dẫn
trứng được tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn.

Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol
Sau khi xuất noãn, nguyên sinh chất bên trong nang noãn tích tụ sắc tố
thể vàng. Thể vàng tiết hormon progesteron. Progesteron vào máu, ức chế phân
tiết gonadotropin từ tuyến yên và ức chế sự chín của nang noãn, kích thích sự
hoạt động của niêm mạc tử cung để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ và phát
triển, ức chế co bóp của tử cung, giảm hormon thùy sau của tuyến yên trong
thời gian gia súc có chửa và thúc đẩy tuyến vú phát triển.

Hình 2.2: Progesteron
2.1.3. Buồng trứng heo và chó
2.1.3.1. Buồng trứng heo [6]
Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc
bụng. Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ 3 đến ngày 12 sau động dục vì
thể vàng phát triển. Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 và giảm
dần do thoái hóa.
Màu và cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian. Thể vàng có màu đỏ
sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 và màu kem hơi vàng và trắng dần vào
ngày 15 – 18. Ngày thứ 3 có cục máu đỏ sậm ở giữa thể vàng, ngày thứ 6 cục
máu được thay thế bởi mô liên kết hoặc bởi dịch hơi vàng, đến ngày 16 – 18 có
nhiều mạch máu. Lúc bắt đầu động dục của chu kỳ tiếp theo thể vàng thoái hóa,
đường kính của thể vàng chỉ còn 50 % và mất đi vào ngày 40.
Số nang tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong
quá trình phát triển là 95 %. Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước

trình thụ tinh.
Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi là
màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi
5
dưỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng
trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao.
2.2.2. Các giai đoạn phát triển của nang noãn và noãn
Quá trình hình thành nang noãn xảy ra ở lớp vỏ buồng trứng, từ những
nang noãn nguyên thủy phân bố ở vùng ngoại biên. Ở thời kì sau thai, nang
noãn không ngừng được hình thành và phát triển từ biểu mô phôi thai.
Quá trình hình thành noãn gồm 7 bước: sinh tế bào mầm nguyên thủy
(PGC – primordial germ cells); di chuyển PGC tới tuyến sinh dục; định vị PGC
trong tuyến sinh dục; biệt hóa PGC thành noãn nguyên bào; tăng số lượng noãn
nguyên bào; bắt đầu giảm phân; dừng ở giai đoạn nhân đôi prophase I [26].
Từ PGC trở thành nang noãn được bọc bằng tế bào dẹt, nó biến thành
nang quá độ. Song song với quá trình giảm phân, nang quá độ nổi lên từ vùng
vỏ và chứa một noãn được bao quanh bởi một lớp tế bào sinh dưỡng, gọi là tiền
tế bào hạt. Tế bào sinh dưỡng miền vỏ có nguồn gốc từ tế bào biểu mô bề mặt
di chuyển ngược vào buồng trứng và tế bào hạt có nguồn gốc từ tế bào trung
thận di chuyển xuyên qua buồng trứng (Sawyer và cs, 2002) [29]. Ở cừu, noãn
quá độ có đường kính 25 – 53 µm, noãn đang biệt hóa là 17 – 22 µm và noãn
nguyên bào 13 – 17 µm, điều đó chứng tỏ tế bào mầm tăng trưởng trước, trong
và sau quá trình tạo nang noãn (Mc Natty và cs, 2000) [20].
Từ nang quá độ phát triển thành nang bậc một. Nang bậc một chỉ chứa
một lớp tế bào hạt bao quanh, giai đoạn chuyển thành nang bậc một chậm hơn
so với quá trình tăng trưởng của nang.
Từ nang bậc một phát triển thành nang bậc hai, có từ 2 lớp tế bào hạt trở
lên. Khi noãn tăng trưởng, tế bào hạt tăng sinh dày, lớp tế bào vỏ hình thành
xung quanh tế bào hạt. Giai đoạn này tăng RNA, protein, ribosom, ti thể và một
số chất hữu cơ khác.


Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37]

2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn
2.2.3.1. Nang noãn heo [6]
Đường kính trung bình của nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 của
chu kì, đạt tối đa 9 mm. Nang noãn lớn có thể được thấy vào 18 giờ sau khi bắt
đầu động dục nhưng sau đó sự thay đổi kích thước lại biến động. Kích thước
của nang chưa đủ đánh giá vì đường kính nang khá biến động lúc xuất noãn.
Nang noãn
bậc 3
Nang bậc hai

Nang bậc hai
Nang bậc ba
7
Màu của nang noãn trưởng thành là màu hồng vỏ sò, do mạng mạch máu
nằm dưới bề mặt nang noãn. Vùng trong suốt của đỉnh nang noãn là nơi xuất
noãn. Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ và dịch hơi đỏ xuất hiện ở bề mặt
nang noãn. Điểm vỡ vẫn có thể thấy được vào ngày 12 sau động dục.
Động mạch xung huyết và tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất
huyết, hiện tượng này thường xuất hiện trên heo. Khi xuất noãn, nang nhuộm
đỏ và đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống và xuất hiện dịch đỏ trên bề mặt.
Khoảng 2 – 3 ngày trước động dục, nang noãn lớn nhanh, lúc này có sự
triển dưỡng của lớp màng bao trong của nang noãn và hòa tan một phần tế bào
hạt tụ nên noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. Noãn tự trải qua giai đoạn giảm
nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển về phía ngoại vi của tế bào và thể cực thứ nhất
được tạo ra. Lúc xuất noãn, thể cực thứ nhất được đẩy ra và trục của thể cực thứ
nhì được tạo nên.
2.2.3.2. Nang noãn chó [6]

và số nang noãn tịt bị ảnh hưởng bởi lượng kích dục tố. FSH kích thích tạo cầu
nối ở tế bào hạt. LH quan trọng hơn FSH trong phát triển nang bậc hai vì qua
thụ thể LH ở tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích
tạo thụ thể FSH ở tế bào hạt, do đó tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34].
Ở giai đoạn này, người ta cũng phát hiện GH (growth hormone) làm tăng sự
phát triển in vitro của nang bậc hai trên chuột (Liu và cs, 1998) [14].
Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể
FSH ở tế bào hạt nhưng chưa phụ thuộc vào kích dục tố. Ở giai đoạn này tế bào
bao nang tăng tiết steroid, trong khi tế bào hạt mất aromatase (loại enzyme biến
đổi androgen thành estrogen). Điều này chứng tỏ rằng progesteron và androgen
mà không phải estrogen là những hormon steroid được tạo bởi nang xoang giai
đoạn sớm. Trong nang xoang giai đoạn sau, có hiện tượng giảm FSH, nang
noãn tiết nhiều estradiol và inhibin và có khả năng xuất noãn. Những nang còn
lại phát triển bất thường và trở thành nang tịt.
Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa và
nang có khả năng xuất noãn.
9

Hình 2.4: Nội tiết nang [36]

2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn
2.2.5.1. Quá trình trƣởng thành
Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn
bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể và dừng lại đến
khi thú cái thành thục về tính. Khi heo cái xuất noãn, noãn tiếp tục phát triển
đến MII và chờ thụ tinh. Trên chó, noãn rụng trước khi tạo thể cực thứ nhất. Sự
tạo thể cực thứ nhất hoàn tất khoảng 48 – 60 giờ sau khi xuất noãn. Nếu được

A,B,C, có ở động vật có xương sống, là vị trí kết hợp của MPF. GVBD xảy ra
khi 3 mảnh này biến mất; MPF hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các phân tử của
mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer. Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội
chất gắn với màng nhân ngoài cũng vỡ.
(4) Tạo trục metaphase
Trong quá trình trưởng thành, trục được tạo hai lần, MI và MII. Trục MI
xuất hiện sau tác dụng của MPF và hoàn thành khi MAP kinase được hoạt hóa.
MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α và β tubulin, do đó tăng
biến đổi của chúng.
Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi và đi về hai cực tế bào. Vi sợi
tỏa ra từ hai cực và tìm bắt cặp NST chị em. Cyclin B gắn với vi ống, MAP
kinase gắn với cực. Giảm phân ở noãn khác với nguyên phân ở tế bào sinh
dưỡng: không có trung thể, giống tế bào thực vật. Trên heo, sau GVBD, NST
tạo dạng đám bụi, theo Motlik và Fulka mô tả đây là giai đoạn hướng cực
muộn. Vi ống bị cắt và tỏa xung quanh đám bụi này.
2.2.5.2. Các chất liên quan
(1) MPF
Theo Masui và Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn khi
được cung cấp bên ngoài noãn, nhưng thất bại khi tiêm vào noãn [19]. Do đó,
11
chỉ tế bào chất gần bề mặt noãn nhận tín hiệu hormon. Noãn sau khi nhận tín
hiệu hormon đã tạo yếu tố thúc đẩy trưởng thành gọi là MPF (maturation
promoting factor hoặc M phase promoting factor).
MPF gồm một đơn vị thủy phân Cdc2 và đơn vị điều hòa cyclin B. MPF
xuất hiện trong giai đoạn cô đặc NST, biến mất nhân con. Trong giai đoạn vỡ
màng nhân, Cdc2 kinase kích hoạt, nhưng theo Kubelka và cs (2002), màng
nhân vẫn vỡ mà không có Cdc2 kinase dưới một số điều kiện đặc biệt, trong khi
đó MAP kinase xuất hiện với hoạt động yếu [13]. Giai đoạn tạo trục chỉ bắt đầu
khi Cdc2 kinase hoạt động và hoàn tất khi xuất hiện MAP kinase.
(2) MAPK (mitogen activated protein kinase)

thông tin giữa noãn và tế bào hạt và do đó sẽ tăng giảm phân [28]. Nếu ít noãn,
tỉ lệ giảm phân cũng giảm. Tỉ lệ giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là
1:10. Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 %
nếu 5 noãn/100 µl [25].
Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi với tế bào ống dẫn trứng
đơn lớp. Bogliolo và cs (2002) nuôi noãn chó đạt 23,2 % sau 72 giờ [4].
Hệ thống nuôi với ống dẫn trứng, rất tốt vì gần giống điều kiện in vivo,
có nhiều tế bào hơn so với hệ thống tế bào đơn lớp, có sự tiếp xúc giữa lớp nhầy
và noãn, và một số yếu tố dinh dưỡng cũng như yếu tố tăng trưởng cần cho
trưởng thành. Luvoni và cs (2003) nuôi noãn chó đạt 31,9 % sau 30 giờ nuôi
[15].
2.3.3 . Yếu tố ảnh hƣởng IVM
2.3.2.1. Thời gian
Buồng trứng được thu từ lò mổ là nguồn tế bào trứng cung cấp cho IVM.
Thời gian vận chuyển đến phòng thí nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến tế bào trứng.
Buồng trứng giữ ấm 30 – 37
o
C trong nước muối sinh lý vào khoảng 1 – 2 giờ.
Thời gian nuôi trứng rất quan trọng, trên heo nuôi 44 – 48 giờ. Trên chó còn
nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 %
và sau 96 giờ thoái hóa 94,8 % [16].
2.3.3.2. Nồng độ oxi và nhiệt độ
Oxi ảnh hưởng lớn đến trưởng thành nhân trên chuột và bò, mức oxi 5 %
tốt hơn 20 % trong không khí [9].
Nhiệt độ nuôi cấy dao động 37 – 39
o
C.
2.3.2.2. Môi trƣờng nuôi
Có hai loại môi trường nuôi cấy, môi trường đơn giản và môi trường
phức tạp. Môi trường đơn giản là dung dịch muối bổ sung nguồn năng lượng

Để lấy noãn ra khỏi nang, có nhiều cách, trong đó cắt và hút là hai cách
phổ biến nhất. Hút là dùng kim và syringe đâm vào nang và dùng lực hút để
14
hút noãn. Cách này thu noãn nhanh nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công
thấp, vì làm mất lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt tụ.
Cắt là dùng dao xẻ nang noãn và vuốt nhẹ để noãn tách ra khỏi liên kết
với tế bào của nang. Cách này chậm nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công
cao. Nếu thu noãn heo bằng phương pháp hút, tỉ lệ trứng ở GVI thấp hơn
(45 %) so với cách cắt (78 %) [33].
2.3.4. Thành phần môi trƣờng IVM
2.3.4.1. Thành phần chính
(1) Nƣớc
Nước là thành phần chính cho mọi môi trường. Chất lượng của nước rất
quan trọng, nước có chất lượng tốt phải qua hệ thống chưng cất, siêu lọc nhằm
loại bỏ các chất khoáng và ion tồn tại trong nước. Hấp khử trùng để tiệt trùng.
(2) Nguồn năng lƣợng
Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng
lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi. Tuy nhiên, tùy giai đoạn
phát triển mà trứng hay phôi có nhu cầu năng lượng với từng cơ chất khác nhau.
Thêm glucose vào môi trường chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 Mm : 1 mM) làm
tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột [8]. Thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi
cấy không tăng tỷ lệ thành công IVM trên chó. Glucose không đủ cung cấp
năng lượng cho noãn chó cũng như noãn chuột, hoặc nồng độ glucose cao
(20 %) ảnh hưởng xấu lên phát triển nhân của noãn chó. Glucose tăng kích cỡ
tế bào hạt và trưởng thành nhân trên noãn bò.
Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII
(71,9 %) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6 %) [18].
(3) Nguồn protein
Vai trò protein trong môi trường không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn
là chất hấp thụ ion kim loại độc.

nhằm bảo đảm áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều
hòa này, nhưng chủ yếu là Na
+
, K
+
. Hàm lượng ion trong môi trường dựa trên
thành phần các chất khoáng trong huyết tương của máu.
(5) Hệ đệm
Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO
2
. Cơ chế đệm của
hệ này giống với hệ đệm sinh lý máu. 16
(6) Kháng sinh
Kháng sinh được sử dụng với mục tiêu hạn chế sự nhiễm khuẩn. Các loại
thường sử dụng là penicillin, streptomycin, gentamycin.
2.3.4.2. Các thành phần khác
(1) Hormon
Nhìn chung hầu hết các môi trường đều được bổ sung hormon, đặc biệt
LH/FSH. Có nhiều báo cáo cho rằng hormon trong môi trường nuôi noãn chín
không chỉ tạo thuận lợi cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hưởng
đến quá trình chín tế bào chất của noãn heo ở điều kiện in vitro. Ngược lại, một
số báo cáo cho rằng noãn heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trường
không có hormon. Vì thế hormon cần được bổ sung hay không vào môi trường
nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề tranh luận.
Môi trường không có FSH giúp noãn vượt qua chướng ngại trong giảm
phân, nhưng không giúp trưởng thành hơn được. FSH giúp trưởng thành bằng
cách điều hòa cAMP, FSH giúp hạt tụ dãn nở.

dục tố lên việc trưởng thành của noãn (Byskov và cs, 2002 và Trafriri và cs,
2002).
Nếu IVM được ứng dụng trên vật nuôi thì có tiềm năng thật sự, nhưng
tình hình hiện nay trên chuột tỉ lệ thành công còn thấp, chủ yếu phát triển tới
giai đoạn phôi dâu rồi dừng (Smitz và Cortvrindt, 2002).
Gần đây (24/04/2005), cùng với việc cho ra đời thành công chú chó
Snuppy bằng kỹ thuật sinh sản vô tính, các nhà khoa học của Đại học quốc gia
Seoul hy vọng đây là bước khởi đầu của kỹ thuật tạo một số nội tạng thay thế
cho người để tránh phản ứng loại thải. Đây là bước đột phá lớn trong khoa học,
thao tác trên chó khó hơn các loài khác vì noãn chó chỉ trưởng thành 2 – 3 ngày
sau khi được xuất noãn (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). 18
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: từ 15/3/2005 đến 15/8/2005.
Địa điểm: phòng Sinh lý Sinh hóa và phòng Nuôi cấy tế bào, khoa Chăn nuôi Thú y,
trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
3.2. Nội dung khảo sát

Nội dung Chi tiết
Khảo sát buồng trứng heo - Trung bình số lượng hoàng thể, nang noãn ở các
mức đường kính nang (< 4 mm; 4 – 6 mm; > 6 mm)
(a) Buồng trứng dài 1 cm (b) Buồng trứng dài 1,5 cm (c) Buồng trứng dài 2 cm
Hình 3.2: Buồng trứng chó

3.3.2. Hóa chất (xem thêm mục pha môi trường)
Dung dịch NaCl 0.9%
Cồn 70
o

Môi trường DBPS
Môi trường HEPES
Môi trường TCM 199
Dầu khoáng
Một số chất phụ thêm vào môi trường nuôi trứng chín.
Một số hóa chất dùng để nhuộm.

3.3.3. Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngược (Olympus)
Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800)

20
Tủ ấm CO
2

Tủ thao tác vô trùng



Thu nhận buồng trứng
Cắt nang noãn
Tìm và rửa noãn
Nuôi noãn
Thu nhận noãn sau khi nuôi
Bước đầu đánh giá số hoàng thể,
số nang noãn ở các mức kích
thước
Thực hiện cắt nang noãn
Lấy noãn bằng phương pháp xé
Phân loại noãn
Dùng kim và syringe hút noãn
Dùng kéo cắt 2 buồng
trứng ở 2 bên sừng tử cung
Rửa bằng cồn 90
o

Rửa bằng nước muối
0.9 %
Trữ trong nước muối sinh
lý ở 30 – 37
o
C
Vận chuyển nhanh về
phòng thí nghiệm
23
3.4.3. Đánh giá buồng trứng chó

Chuẩn bị 4 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự.
Đĩa 1 chứa 500 μl ECS; 50 μl pyruvic acid; 50 μl estradiol; 50 μl FSH; 50
μl hCG; 4300 μl môi trường căn bản TCM 199. Hút 2ml dung dịch ở đĩa 1
cho vào đĩa 2. Đĩa 1 và 2 dùng để rửa noãn.
Các đĩa 3 và 4 dùng để nuôi noãn trong hệ thống giọt, mỗi đĩa chứa 100 μl
dung dịch từ đĩa 1 và phủ dầu khoáng. Để tránh giọt môi trường vỡ, hút 50
μl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 μl còn lại. Hai đĩa này dùng để nuôi 2
loại noãn có đường kính nang noãn < 2 mm và > 2 mm.
3.4.5. Tìm và rửa noãn
3.4.6. Chuyển noãn vào môi trƣờng nuôi
Chuyển các noãn sau khi rửa vào môi trường nuôi noãn chín tương ứng từng
mức đường kính nang. Trên heo mỗi đĩa chứa khoảng 30 – 50 noãn, chuyển thành
từng nhóm tránh phân tán, nuôi ở điều kiện 38,5
o
C, 5 % CO
2
, 40 – 44 giờ. Trên chó
mỗi đĩa chứa khoảng 10 noãn, nuôi ở điều kiện 37
o
C, 5 % CO
2
, 72 giờ.
Hình 3.5: Noãn trƣớc và sau khi tách tế bào hạt tụ
3.4.8. Đánh giá phân loại noãn
Ta đánh giá và phân loại noãn trước khi nuôi và sau khi nuôi. Chất lượng noãn
trước khi nuôi khác nhau là do bản chất noãn hoặc do cách thu nhận noãn. Noãn được
thu hoạch phải có hình dạng tròn đều, noãn được phân làm 3 loại:
Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh.
Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh.
Loại C không có hạt tụ bao quanh.

Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa DPBS
Thêm hyaluronidase 0,1 % vào để trong 15 phút
Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn
Đánh giá phân loại noãn
Chuyển noãn qua lame thực hiện bước nhuộm nhiễm sắc thể
(a) Noãn trước khi nuôi (a) Noãn sau khi nuôi