BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

PHẠM THỊ SƯƠNG
ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN THUỘC CHI
PROTEUS PHÂN LẬP TỪ ĐỘNG VẬT BIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. NGUYỄN VĂN DUY

NHA TRANG – THÁNG 07 NĂM 2013
i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự chỉ bảo, giúp

1.1.2. Đặc điểm sinh học của Proteus 1

1.1.3. Đặc tính sinh lý và sinh hóa của Proteus 3

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về chi Proteus trên thế giới và ở Việt Nam .
6

1.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1. Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống 7

1.2.1.2. Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống 9

1.2.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus 12

1.2.2.1. Định danh bằng test hóa sinh 12

1.2.2.2. Định danh bằng sinh học phân tử 13

CHƯƠNG 2. Vật liệu và phương pháp 16

2.1.

Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1.

Chủng vi khuẩn 16


2.3.3.1. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 20E 23

iii

2.3.3.2. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 50CH 24

2.3.4.

Kĩ thuật tách chiết DNA tổng số 26

2.3.5.

Kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB 27

2.3.6.

Kĩ thuật điện di gel Agarose 29

2.3.7.

Giải trình tự và phân tích trình tự gen 30

2.3.8.

Phân tích quan hệ phát sinh loài 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1.


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤCiv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt

Viết đầy đủ
1.

DNA Deoxyribonucleic Acid
2.

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate
3.

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
4.

LDC Lysine Decarboxylase
5.

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid
6.


Hình 1.2:

Sự lan tỏa (swarming) của Proteus mirabilis trên môi trường thạch 3

Hình 1.4:

Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một bề
mặt 5

Hình 1.5:

Minh họa 4 giai đoạn trong một chu kỳ lan toả của tế bào Proteus
mirabilis 6

Hình 2.1:

Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài 21

Hình 3.1:

Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 33

Hình 3.2:

Hình ảnh nhuộm Gram tế bào của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 34

Hình 3.3:

Kết quả điện di DNA tổng số của các chủng cần định danh 41



Bảng 2.2:

Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 20E 23

Bảng 2.3:

Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 50CH 24

Bảng 3.1:

Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn bằng bộ Kit API
50 CH và API 20E 36

Bảng 3.2:

Đặc điểm sinh hóa khác biệt của 5 chủng nghiên cứu với các loài của chi
Proteus 39

Bảng 3.3:

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7A (1024
nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.4:Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng B3.7A (893 nucleotide)
với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.5:

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10B (1062


Bảng 3.11:

So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng N1.4 (835 nucleotide)
với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54

Bảng 3.12:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng N1.4 (881nucleotide) với các
trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54

Bảng 3.13:

So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng nghiên cứu với các
chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus 55

Bảng 3.14:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng nghiên cứu với các chủng
chuẩn của các loài trong chi Proteus 56

Bảng 3.15:

Đánh giá chung về định danh 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 58

viii
LỜI NÓI ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài:
Vi khuẩn Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae hiện nay
có 4 loài chính bên cạnh đó vẫn còn 3 Proteus genomospecies (4, 5 và 6) vẫn chưa

Nội dung:
- Nuôi cấy, kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 5 chủng
nghiên cứu.
- Xác định khả năng trao đổi chất bằng Kit API 50CH và Kit API 20E.
- Tách chiết DNA của 5 chủng nghiên cứu.
- Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB bằng kĩ thuật PCR.
- Giải trình tự, phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài.
Phạm vi nghiên cứu:
- 5 chủng cần nghiên cứu (B3.7A, B3.10B, CT1.1, G1, N1.4) thuộc chi
Proteus.
Ý nghĩa đề tài:
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp định danh và phát hiện thêm các loài
(thuộc chi Proteus) mới có ý nghĩa trong tiến hóa và đa dạng sinh học. 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Proteus
1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Proteus
Về phân loại học Proteus được xếp vào:
Giới:

Bacteria
Ngành:

Proteobacteria
Lớp:

Grammaproteobacteria

thể còn nhiều thay đổi.
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Proteus
Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm các trực
khuẩn Gram âm, di động mạnh, có lông roi xung quanh. Tế bào vi khuẩn Proteus có 2

nhiều hình dạng thay đổi trên các môi trường nuôi khác nhau, từ dạng trực khuẩn
đến dạng hình sợi dài.

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Proteus vulgaris dưới kính hiển vi điện tử
Proteus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy trong xác phân hủy
của động vật, trong nước thải, trong phân người và động vật. Proteus mirabilis và
Proteus vulgaris đã được phân lập từ đường ruột của động vật có vú, chim, bò sát.
Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước, nước thải và phân. Các loài
khác của Proteus phân bố ít rộng rãi hơn như Proteus penneri không tìm thấy trong
ruột gia súc mà chúng có trong vết thương, mẫu nước tiểu, sỏi bàng quan… [17],
[20].
Proteus sinh trưởng tối ưu ở 37
o
C, chúng dễ dàng mọc trên các môi trường
nuôi cấy thông thường [17]. Trên môi trường thạch dinh dưỡng, vi khuẩn Proteus
phát triển thành khuẩn lạc có dạng một vòng tròn đồng tâm, các vòng tròn lan dần ra
từng đợt, mỗi đợt là một gợn sóng và có mùi hôi.
Trên môi trường có Natri Deoxycholate, Proteus mọc thành khuẩn lạc trơn,
tròn, riêng biệt không gợn sóng, có một điểm đen ở trung tâm, xung quanh màu
trắng nhạt. Các tế bào Proteus phát triển trên môi trường lỏng dưới dạng hình que
ngắn 1,5 – 2 µm với 6 – 10 lông roi quanh bề mặt. Trên môi trường rắn, các tế bào
của Proteus kéo dài 60 - 80 µm với hàng trăm đến hàng ngàn lông roi mới [17].


4

hơn rất nhiều lần so với tế bào bơi ban đầu, chiều dài tế bào lan khoảng 10 µm đến
80 µm với rất nhiều lông roi xung quanh (khoảng 10
3
- 10
4
lông roi).
Bảng 1.1: Một số phản ứng sinh hóa của Proteus
Phản ứng sinh hóa
Kết
quả
Phản ứng sinh hóa
Kết
quả
Arginine dihydrolase
Lysine decarboxylase
Ornithine deaminase
Phenylalanine deaminase
Sinh acid khi len men D-
Glucose
Sinh acid khi lên men
melibiose
Chuyển hóa nitrate từ nitrite

Sản sinh lipase
-
-
+


Các tế bào dàn song song để tạo thành bè có khả năng di chuyển nhanh trên
bề mặt với một số lượng lớn các tế bào lan. Tự tế bào lan không thể di chuyển được
trên bề mặt thạch mà các tế bào lan cần kết bè với nhau (Hình 1.4) [17].

(a) (b)
Hình 1.3: Tế bào bơi (swimmer) và tế bào lan (swarmer) của vi khuẩn Proteus
mirabilis 5

Khi đưa tế bào bơi từ môi trường lỏng vào môi trường rắn (chẳng hạn như
môi trường thạch dinh dưỡng) tế bào bơi sẽ thay đổi về mặt hình thái và sinh lý. Sau
khi tiếp xúc với bề mặt môi trường, các tế bào sẽ nhanh chóng biệt hóa tạo thành các
tế bào có hình thái và sinh hóa đặc trưng gọi là tế bào lan. Ngoài chiều dài và số
lượng lông roi nhiều gấp bội lần so với tế bào bơi thì số lượng nhiễm sắc thể trong
mỗi tế bào cũng tỉ lệ thuận với gia tăng chiểu dài. Đồng thời về mặt sinh lý, có sự
gia tăng đáng kể trong tổng hợp protein và enzym urease được sản xuất với số lượng
cao hơn so với ở trạng thái tế bào bơi từ 30 đến 80 lần. Các polysaccharid được tiết
ra với số lượng lớn từ các tế bào và điều này tạo điều kiện cho việc tăng cường độ
bám dính và di chuyển của các tế bào.

Hình 1.4: Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một
bề mặt

Quá trình lan tỏa của Proteus mirabilis diễn ra theo chu kỳ, mỗi chu kỳ bao
gồm 4 giai đoạn chính
:
+ Giai đoạn 1: Giai đoạn đa bội (là giai đoạn biệt hóa tế bào swimmer thành


như là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. Ở nhiều loài cá, Proteus penneri gây bệnh
xuất huyết [17].
Trong y học, Proteus mirabilis được sử dụng làm kháng nguyên trong phản ứng
huyết thanh chẩn đoán bệnh sốt mò do cấu trúc kháng nguyên oxk của vi khuẩn
Proteus mirabilis tương tự với kháng nguyên của ấu trùng mò Rickettsia orientalis [3].
Trên thế giới đã có một vài nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin của
Proteus [5], [14]. Ở Việt Nam, khả năng sản sinh bacteriocin của chúng đã được bắt
đầu nghiên cứu [24].
Người ta có thể định danh vi khuẩn Proteus bằng sử dụng các kĩ thuật như
xác định đặc điểm hình thái, sinh lý đặc trưng, sử dụng bộ Kit API 20E, sử dụng kĩ
thuật lai DNA-DNA, kĩ thuật giải và phân tích trình tự gen 16S rDNA. Một số
nghiên cứu mới đây sử dụng gen rpoB như chỉ thị phân tử để hổ trợ cho định danh
vi khẩn Proteus đã cho kết quả khả quan với khả năng phân tách tốt hơn nhiều so
với việc sử dụng gen 16S rDNA [8], [13], [17].
1.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn
1.2.1. Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn
Định danh vi khuẩn là công việc xếp loại vi khuẩn theo hệ thống đơn vị phân
loại sinh vật với danh pháp theo thứ tự giới (kingdom), ngành (phylum), lớp (class),
bộ (order), họ (family), chi (genus), loài (species), dưới loài (subspecies).
Có rất nhiều phương pháp để định danh vi khuẩn trong đó có phương pháp
định danh chính như sau:
- Định danh bằng phương pháp truyền thống
- Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống
1.2.1.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống
Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987 khi Ferdinad
Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dáng tế bào. Mặc dù phương pháp này tỏ ra
tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức… nhưng vẫn được sử
dụng để định danh vi khuẩn vì các ưu điểm lớn của nó như: đây là phương pháp tiêu
chuẩn vì nó được xây dựng và phát triển trong thời gian dài được nhiều nước công

Như vậy ta có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau để phân loại và
định danh vi khuẩn. Tuy nhiên, mỗi cách lại có nhược điểm nhất định và không có 9

tính vạn năng để áp dụng cho tất cả các vi khuẩn. Vì vậy để có kết quả chính xác
hơn cần phải kết hợp các phương pháp để định danh.
1.2.1.2. Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp truyền thống, nhiều phương
pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa như phương pháp
miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot) và các kỹ thuật sinh học
phân tử như PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR… Các phương pháp này gọi
chung là các phương pháp hiện đại. Đặc điểm chung của các phương pháp này là
cho kết quả nhanh hơn phương pháp truyền thống và có thể áp dụng cho tất cả các
vi sinh vật kể cả các vi sinh vật khó có khả năng nuôi cấy như các xoắn khuẩn (tác
nhân gây bệnh giang mai), các tác nhân gây bệnh đường sinh dục, vi khuẩn lao,
Helicobacter (Hp)…
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Hiện nay
kĩ thuật này đã được cải tiến rất nhiều so với bản gốc của chúng và được sử dụng
rộng rãi nhất trong việc định danh phát hiện các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh
PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn từ một trình tự
đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của trình tự khuôn thành hàng triệu
bản sao khác nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc
hiệu cho đoạn DNA này.
Nguyên tắc chung của phương pháp PCR: phản ứng PCR là một chuỗi các
quy trình kế tiếp nhau dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động
tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ
tăng theo mỗi chu kỳ của phản ứng.

Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1 – 2,5 đơn vị (u) cho
100 µl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25 µl. Nếu nồng độ
Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm
sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme
để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn
+ Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây
chuyền tổng hợp DNA. Mồi là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại
của một thí nghiệm PCR.Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp
PCR và phải tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
• Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung
giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có cấu trúc kẹp tóc do có
sự bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi. 11

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC
lặp đi lặp lại nhiều lần.
• Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên trình tự nhỏ hơn 1 kb.
+ Nồng độ các dNTP
Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphate) thường được sử dụng là 20 –
200 µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh’’. Bên cạnh đó, sự cân
bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Mất cân bằng
trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
+ Nồng độ Mg

-10
3
thì số chu kỳ thường cần khoảng 35-40 chu kỳ…
Trong thực tế, không vượt quá mức 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR vì phản
ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên
theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm
hẳn vì các nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản
ứng, sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng
hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. 12

1.2.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus
1.2.2.1. Định danh bằng test hóa sinh
Yêu cầu đầu tiên cũng là quan trọng đối với test sinh hóa là phải thu được các
khuẩn lạc đơn, thuần khiết để việc định danh được chính xác hơn. Việc định danh
này được thực hiện dựa vào các đặc điểm kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng trao
đổi chất của vi sinh vật. Các cách để tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa
dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống, sử dụng bộ Kit và dùng các thiết
bị tự động.
Các thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí
nghiệm khác nhau trên thế giới được tổng hợp thành những bản định danh vi sinh
vật. Bảng sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân loài vi
sinh vật được biểu thị bằng một trị số là tỉ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết
quả dương tính theo thống kê ở một loài sinh vật.như vậy, trị số 100 có nghĩa là
100% trường hợp của loài này đã thử đều cho các thử nghiệm dương tính, ngược lại
số 0 có nghĩa là có 0% trường hợp thử nghiệm cho kết quả dương tính. Trong thực
tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy ước bằng các ký hiệu
như (+): dương tính, (-): âm tính; (+/-) khoảng trên 70% là dương tính và (-/+)

phản ứng quan trọng đặt trưng để phát hiện các loài thuộc chi Proteus (chi Proteus
mà chúng ta cần định danh thuộc họ Enterobacteriaceae).
1.2.2.2. Định danh bằng sinh học phân tử
Ngày nay sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân
loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp hiện đại trong
định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong
một thời gian ngắn. Phân tử 16S rRNA ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm
men thì tình tự D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến
để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và
định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức
năng không đổi, phân tử 16S rRNA còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào,
có tính bảo thủ cao nhưng vẫn có sự khác biệt giữa các loài và đặc trưng cho từng
nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ kích thước vừa
phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự. Các trình tự 14

rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng vì DNA là vật liệu dễ
thu nhận và có tính bền cao hơn so với RNA.
Việc định danh bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA là một công cụ mạnh mẽ và
đến nay đã trở thành kỹ thuật phân tử phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để xác
định sự khác biệt các loài vi khuẩn bằng sinh học phân tử [15] tuy nhiên kĩ thuật này
cho khả năng phân tách loài chưa tốt và không có hướng dẫn thống nhất để xác định
thế nào là một loài dựa trên chỉ thị phân tử 16S rDNA, một chủng với mức độ tương
đồng lớn hơn 97% có thể hoặc không thể thuộc cùng một loài vì thế cần có những kĩ
thuật bổ trợ để xác định chính xác được đến mức loài cho vi khuẩn [17]. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra những vấn đề còn hạn chế của việc sử dụng chỉ thị phân tử 16S
rRNA và chứngng minh khả năng phân tách loài khi sử dụng chỉ thị phân tử rpoB để
bổ trợ cho việc định danh đến loài nhất họ Enterrobacteriace [5], [15], [16]. Đặc biệt