ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
Tên để tài:
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VẢ NGHIÊN CỨU TĨNH CHAT MỘT VẢI
ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TÙ'CÁC NGUổN
VI SINH VẬT CỦA VIỆT NAM
* *
Mã s ô : QG. 97.10
Cliiì trì đề tài: P(iS. TS. Nguyền Ván Mũi
ĩIà nôi, tháng; 1 -2000
ĐẠI HỌC QUÔC GIA HA NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VÀ NGHỈÈN CỨU TỈNH CHẤT MỘT VÀI
ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỚN
VI SÍNH VẬT CỦA VIỆT NAM
í •
MÃ s ố : ọ c. 97.10
Chủ í rì dể tài: PGS. TS. Nguvễn Vã II Mùi
Các cán bộ than ỉ gia:
GS. TSKH. Nguyễn Đình Quyến
TS. Phan Tuân Nghĩa
TS. Vũ Thị Minh Đức
IliS. Ta niị Bình
CN. Phạm Hài Yen
CN. Niỉiiycn Tliị Bích Liên
ỉ là nội, tháng j -2í )(}{>
M Ờ 7 ® d L / H Ơ Q l
ĐỔ hoàn thành đề tài nghiên cứu này, cluing lỏi xin cliíìn thành cám ƠI1 Ran
Giám Đốc, Ban Khoahọc Công nghệ - Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Ban Ciiám
lining khoíiim (>0 kỊ)a.
- Điổi! kiện phán ứng thích hợp cho enzim Hac III eLU) chum: vi UtiiMii
Iiíty 1Ỉ1 (ỈỌm NIĨR2, ioil MíV + và ờ nhiệt độ 37°c
( ) mọi chủng xạ kliufin cung (iã phát liièn ró rn/im íỉiiii h;m
< 'hung \ọ liiin i! 18 (.0 l!iC là Sítcll (cn /in i c:H A D N À I;||> ff;ìM VI l<") V.I
V !"'mg .\ạ kfiu;:m 20 Ihô tìi Xíin I iar/,im cat /M)N lan drill sole).
í o (bu IrJ <k' f:ii ( lui Iihlém il(' f;ii
( ’«> (ịtííin (ỊHÓn ly dế Ini
SUMMARY
Restriction cndonucleases can cleave DNA molecules at specific scquenccs.
Il is therefore a useful tool for molecular biology and biotechnology. At
present, about 400 restriction enzymes have been purified from thousands of
isolated ones.
Restriction enzymes are present in many bacteria and in our counfrv. I here
has been a variety of micro-organisms which then becomc a plentiful MHitt c
of restriction endonucleases. Tims we investigate, isolate and puril'v scvciiil
restriction enzymes from a small number of micro-organisms isolated ill
Vietnam. TTiis project has been carried out for 2 years from 7-1997 to
7-1999 and following results are obtained:
- One strain containing restriction enzyme with a very high ;u livily
has been found within 5 isolated baclerial strains, which coiislitiiles a ratio
of 1/5. Among 13 investigated Streplomyces strains, 2 strains arc probably
found to contain restriction enzymes (a ratio of about 1/6).
- The above restriction enzyme is determined to be Hac III. an
enzyme cleaves X DNA lo give blunt ends,
- The extracting buffer of this bacterial strain has a wide pll range.
Imm 5.5 !o 8.0 and is inhibited al a NaCl conccntralion of 0.3M.
- When purifying through ion-exchange column DEAR-( cllulose.
line ill is eluted at 0 2M NaCI.
Mae II! is purified by affinity column Scphanw CL-6B Heparin. Il
ilium “con này cat ÀDN ở bât cứ vị trí nào người thí nghiệm menu muôn,
i uv (lòn nay tlã có hơn 400 loại R1Z được iinh sạch và Ir(V lliiinh lliiMng I'ltfim
Imng số híinti nghìn loại được phái hiện, nhưng chínlì bới nhung lý tỉ«> liên mà
MÍIÌIY lìíiy MíM.iòi !;i Víĩn tiếp lục lìm kiẽm các RE lừ Iiliicu Million kluít nh;nj.
I IICO Đỏ Đình Hồ, các cnzyni này có mặt ớ h;'m hẽi t ;ic loiii vi khuiMi.
n.ìv chính là (licit kiện fhuân lợi Irong neliiên cứu vổ RE cu 11 í: nhu tmiiìi kil l
lúMiti ( ling câp mộ! lượng lớn sinh khôi làm nauyèn liệu cho cone Iiíiliệ s;In
MiiH Rf;, đ;ii Irìi. Nước (a nam trong vìrng khí hậu nliicl IỈI moi 11 u<
thuân lợi cho sự phát Iriển đa dạng của vi khuẩn. Do vậy, sẽ có nhiên luía hẹn
trong việc tìm kiếm các RE từ nguồn nguyên liệu phong phú này ò' Việt Níim.
Mục tiêu đề ra của đề tài là:
- Điều tra sự có mặt của RE ờ một sô chủng vi sinh vật phân l;ìp Ỉ1 Việi
Nam.
'illrun (Jò phương pháp tách chiết và mội sỏ' diều kiện pliiin ứng cua
cii/ym giới hạn của mội chùng vi sinh vật.
- Bước (lầu linh sạch cn/ym giới hạn trong điểu kiện hiện có cua
phòng thí nghiệm góp phần vào nhũng nghiên cứu cơ bán về cnzym gi'fi lum.
Cóng trình này ilưực thực liiện lại Bộ môn Hoá sinh - Klìoa Sinh học -
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Há nòi tỉr 7/1W7 (tòn
7/1 í-m.
-2-
V NỘI DUNG
1.1
NCỈUYẼN LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NCỈHĨÍ N cứu
1.1.1 NGUYÊN LIỆU
Đôi tượng: Chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đê điều Ita CM/Yin uitíi h;m
(lược pliiìn lập lu Bộ mòn Vi Sinh học. Trim£2 làm Vi sinh vật học úng climti.
Khoa Sinlĩ lioc- Trường đại học Khoa học tự nliièn Đại hoc Ụuỏc gi;< Fill nói.
Gk: nòi vi sinh vật để ti lử hoạt lính lizozym do phòng sinh hoc pliiìn
lử Viện Vệ sitih dịch tễ cung cấp
nội ticII đạt yèu cầu dùng Irong nghiên CỨLI
1.1.2. PHƯƠNG PHÁI’ NGHIÊN cửll
1.1.2.1. NlíOỉ CÂY XẠ KHUẨN
Chủng vi sinh vật nghiên cứu dược nuôi tiên mói mrớng (lia ihíicl) hpl
có lliiinh phiìn !ihư sau.
KJIPO, lg
NaCI ! £
M g S O :. 7Ỉ U ) Ig
-4-
CaCO, : 2g
(NH4),S04 2g
Tinh bột l()g
Agar : lOg
Khuẩn lạc sau khi mọc trên dĩa thạch dược chuyên sang mini c;ìy moi
trườiìg dịch ihể LB có thành plìần như sau:
Pcplon JOg
Cao nàm I11C11 5íi
Na( 1 l()g
II/) I.OOOml
Các môi Inrờng được khửliìmg ờ 1 atm trong 30 phút. Chiiĩự \<\ klmim
(lưực nuôi cày (V 37nc.
-5-
1.1.2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THƯ NHẬN CHẾ PH AM EN7AM
1.1.2.2.1. Tách chiết enzym ri sinh vật từ môi trường nuôi cày
Các lè bào vi sinh vật được (ách ra khỏi dung dịch nuôi Cíìy hang c;kli
ly tâm 50(K) v/p trong 10 phút ớ 4°c. Loại bò dịch, thu lây cạn k' bao. sinh
khối vi sinh vại lũ:II chua sử dụng (lược cát giữ trong 111 kinh ờ 4' c. ktra le bào
bằng tiệm plúi tè bào SB ( lOmM Tris-HCI: O.lmM EDTA; HhnM
mercíiploekinol; 0,2°v Trixlon X-100; Imỉvl NaN,; y < dyxcrol; 5()niM N;i(1:
pỉỉ 7.4Ớ25"C).
(b), tièp lục- [ilia ioãng. I;t> niffic c;ii did them K> ụ I dịch b 'c■) I.;'|\ > pi
(lịch c < I()r'> t'A\- (toil lên (tia thạch. II Ờ 37 Ocm so iưỢĩìii \v K|'V
-6-
- Phản ứng của enzym giới hạn có sự tham gia cùa lizozym
Lííy 5 ống nghiệm, cho 25 fil đệm phản ứng TR (lOmM Tris HO;
10 niM MgCl?; lOmM 2- mercaptoelanol; 50mM NaCl; pM 7,5, tho sau khi
đã khử trùng), 2 ul AND (Pha loãng 500 rnicrơgam/microlií), I fil eii/ym Iiiới
hạn (Hindllf, Bíiiii HI, Eco Rỉ), 3 111 lizozym vào các ÔIÌÍZ có nong (tô ctiôi
cù ng là '),/!. 0 ,2 , 0,1 5 và 0,1 m g/m ỉ và óna. đối chứní! không có |ị/i'/vtn. 1 1 ớ
17!lc trong I mờ. Sau (.10 cho vào mỗi ong 10 |.il duiìg (lịch Iigưnu pli;in ứng
(50fỉr glixerin, 50 m M E D T A . pH 8.0 . 0 .02 % biomopheno! blue).
- Pli ;ín ứng với cn/ym giới hạn dịch chiết thô (phá king siêu Hin) C(' \ ;t
0,01 TTig/tnl vói đ ệm Tris - H C 1 10 m M , p H 8 ,0 .
+ Clruẩn bị dung dịch lizozim: Duniỉ dịch có nồng (In 0 .3. ('.2,
0,15 và 0,1 mg/ml với đệm Tris-HCI lOmM, pH 8,0.
+ Phan ứng: Dìing 5 ỏn g ngliiộm đánh ilAu từ I đêu 5 . ('bí' H) |i!
đệm NB vào óng 1, 30 |il vào ông 2.3,4 và 5. Cho 5 fil dịch chiêl tim villi OIIỊI
!, trộn đcu. LAy 15 f.i! dịch từ ô n g 1 ch o sang ót UI 2 , tròn (leu. là'. 15 |il (lịch 1
lừ ốiiịì 2 cho sang óng 3, tiên hành tiếp lục (lẽn OTIÍI .“v ()MLI > h('» (li I 5 |il (lịch.
Nịuí vậy, mồi óng nghiệm có 30 ^tl dmig dịch có nong rlò clịcli chic! !liõ iirưng
ứng 1/9, 1/27, 1/81, 1/243, 1/729. Cho vào mỏi ống: 2 |ii AND }. h(‘ặc AND
77, } 111 điihg dịch lizozym lừng loại mồng độ, ỏng (lõi chiniLT không có
li/o/vm, ủ ở 37nc (rong 1 giờ. Cho liếp 10 Ị.il (lung dịch ngưng phán trim .
- Điện <Ji nên gc! agaroza.
G el Hiiaroza 0,7 % (lav 3 - 4 m m . C ho vào m ỗi giénti ỉ:‘> fil (lung
(lịch cua thui 011(2, Iighiệĩn, đối chứns là mẫu AND /. cắt hói ỈIÍIKÌ III. (liên áp
Ị()(ìV . Khi kết ỉhúc điện di, bi’ui gcl clirực nhuộm với clidium liromii (10
mgẠil). Cik’ hănc AND dược phái hiện và chạp hằng ;inh pnlamid.
l.ỉ.2.2.3. Phưong pháp xác định hàm lượng protein
Đo độ hấ|> thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm v;'i 280 lìm \h lính Ilico
1.1.2.3. XẮC BỊNH HOẠT TÍNH PHẢN CÁ l AIiN CÙA ENZYM
GIỚI HẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN (ỉIX
AGAROZA
1.1.2.3.1. Thực hiện phản ứng
Pha loãng dịch ehiêl rú! thô V<Vi các riổng độ kliííc nhau trong (Imig (lie’ll
rlỌm phán ứng NEB 2 ( lOmM Tris MCI; lOmM MgCI?; 50ml NaCI; ImM I)1T
pH 7,(J ờ 25"C). Từ mõi dung dịch đó lấy 30 |il cho vào 2 III ADN ) c !iu;ìn
(500 |Lig/ml). l ien hành ủ hỗn hợp phản ứng ở 37nc trong ni(>t pin’. I )(riìịi pli;in
ứng bang cách sue Tilljệt ở 65nc trong 3 phút.
rù' dung dịch phân ứng lày ra 15 Ịil, thêm vào 2|il thuòc ĩilmọm (ỉ 11J) ĩ A
5()inM và bmmophenol xanh 0,02% pha trong glyxerol 5f)rÝ ). Ch Am điện (li
etc phát hiện các băng ADN được ắtí ra nhờ RE trong dịch chiết
1.1.2 ì.2. Chuẩn bị gel agaroza rà chạy điện di
Đệm THE 5X được chuẩn bị bằng cách cán 54g Tris-lwơ \à 2 7 . ;i\i!
boric, Iliêm 20iiil BDTA 0,5 M rồi thin nước cAl liến llít.
Từ 1 BE 5X pha loãng thành TBE I X để đổ gel ilgaroza và cliav (liên (li. (1
(ỉcl agaro/.a O.R^Í' dược chuẩn bị bằng cách (lun sõi 0.24 e ;tn;iio/a
(mng 3()ml 1 HÍI IX. Đổ dung (lie'll agctro/a nguội đen khoáng o n e 1 hì do’ IO11
khuôn °cl (lã cài sim lược. Sau khi gci dóng, cho gcl vìm máy điên (li. (lo I RI-;
-9-
IX v;'in máy sao cho gc! ngập Irong đệm khoảng Imm rồi lút ỉưựr ra. I5|il
(lịch trộn mẫu dược cho lên mỗi giếng.
Chạy diện di ở hiệu điện thê ổn định 40V. Khi vệl chài màu eliiiv <1;In
hết bíin gcỉ thi ngắt dòng. Nhuộm tỉc! bằng dung dịclt etidium hroinii 2rr. I ,;ìy
ụcl ra (lem sui dưới đèn lủ ngoại để quan sát sự phân bõ CUÍI cát' brill” ADN
LI.2.3.3. Xác dịỉiỊi dộ tinh sạch của chẽ phâm enzyni bàng phương
phá p diện di trên geì SD S - Ịĩolyacrvlamit /heo ỉ.ncminli
(ỉ 970).
- ChìKĨìì bị (ỉim% (lịch (ỉé chạy điên di
,\
kích ill ước 0, 1 >'X,()x 10,()cm. Tiièm n;rớc cất lèn lĩén mài gcl c!c míif ucl kill'll]”
I 'Ị oxy hoíí và hồ na phang. Đê gel (lỏng khoảng 30 pill'll 111! ỉnạị bo I < rp mine
phía trê:ì, cài ỉuơc và đổ tiếp lóp gcl lách 4,5% lên phía Ircn. Đê ịicl trùng hợp
giờ impịĩ mi'o’c, '.ail ciỏ íliay íiước hằng đệm điện c ực E. Dùng C’\ linh bơm
30f.ll 1 nAu \’à< 1 mui giếng.
Tier hanh cliịiv íliện di trong tiệm (liện cực với hiệu diện the IOOV. cường (lo
(lòĩig (.liệu 3mA/ giếng. Sau khi vệt châl màu chạy liêl hán gcl, l;ìy gcl ra
nhuộm với dung dịch H. lẩy màu bằng dung dịch I và chụp ánh kc\ quá thí
m nghiệm.
Uung dịch
Loai 1
A B c
ĩ i2o
TRMED
(ỉcl cỏ l.s%
0,3
- 0.5 1.2
0,003
íicl liírli 12.5%
2.5 1.5 - 2.0
O.OÍM
-12-
2. KẾT OUẢ VÀ THẢO LUẬN
2.1 . ĐIỀU TRA Sự CÓ MẶT CỦA ENZYM GIỚI HAN Ở MỘT sò
CHỦNG VI SINH VẬT PHẢN LẬP Ở VIỆT NAM
Nhăm tìm kiếm cấc chủng vi sinh vật chứa enzym giới hạn. chúng tỏi
tiến hành điều tra sơ bộ mộl sỏ chúng vi khuán và xạ khuấn phàn lập ớ Việt
Nam.
2.1.1. Nuối cấy vi sinh vặt
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 chúng vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh
10 pluíl ớ 4°c (lê thu Iày siiili khỏi le bào. l ỉoà các lê bao Irong tiệm MrII ;ìni
ỉ lỉ (hc«> lí lệ ỉu lố bào: 5ml đệm. Có lliê pliá vỡ (ế bìic b;ìng akli Iitiliicn lr
bìio với bột bioxit nhôm hoặc bi tluiỷ tinh. Nhưng cách loi nhàt III HunII
- 14 -
phương pluíp siêu Am. Một vài chung vi sinh vạt phái bo sung 100 ỊiỊi/ml
lvzo/ym nước khi sicu âm 15 - 30 pluìt. Trong nghiên cứu này. (Iimií! lõi sicu
Am phá vỡ 10 hào ớ 8 Ainp trong 3 phút ờ 0"c. Quá Irìnli sicu fill) chun 1 iè11
hành không liên tục, cứ khoảng 15 gifty lại dứng lại mội khn;in<2 tlioi ìinn
liĩơiiịí ứng dê (làm háo khùng cổ sự 5ăng nhiệt (lộ dáng kè lione quá trình súHt
Am làm ảnh hướng đến hoạt lính cùa enzym. Dịch phá lố hào ihrợc ly I;ÌI11
17.000 v/p Irong 30 phiil ở 4°c. 1 ^oại bỏ kct tủa llui l;ìy phẩn 11 ƯỚC H(ii (lè (tit'll
Ira sự có mặt cùa RF£. Thông qua kha năng cắl CIIH cluíng đối với AI >N } (long
(hời (lựa vào (liện di đổ các ctư.viĩi giới hạn chuán có thể xác cĩ ị nil (liKír (hung
IIÌIO có RE hay RH tìm (Urợc la đã biết hoặc chua từiif! pliííl hiện. Hiinii 1 !;i k('l
(]iia C IIÍI quá )rình khán sát với các cluing vi sinh vậl (In dùng.
lỉíin^ í. Kêl qiui kháo SI)
sinh vẠl Irone lự nhiên
sự t ó mật cua
cn/yni giới liíiii
o mol so clmtig \
SI 1
( bung
vi sinh vật
Nuuỏn gôc
ADN tlimg
dể phàn (ích
Ki'1 (|Míi
Ị)h;tn tích
1 Vi kfmfin I Nước thai
ADN )
Chủng
vi sinh vật
Nguồn gốc
ADN dìing
dể phân lích
Ket quà
phím tích
10
Xạ khuẩn Q8
- -
Không cỏ vạch
1 1 Xạ khuẩn Q10
- -
Có hai vạc h
12
Xạ khuẩn Q12
-
-
13 Xạ khuẩn 5
-
Có 2 vạch mờ
14 Xạ khuẩn 6
-
15 Xạ khuẩn 9
- -
16
Xạ khuíỉn 1 1
-
17 Xa khuẩn 12
- -
kết qua mà lác giả Lê Thị Kim Tuyến tlưa ra khi tiến hành dicu la Rĩ; cua
2000 vi sinh vật là I/5-1/6. Nguyền Thị Vân Anh (1993) cíing (liều Ii;i 17
chủng vi sinh vệt và đã tìm được một chúng xạ khuẩn có RE A va II và pliál
hiện sự có mặl cua hai RE khác trong hai chúng vi khuẩn. Sự khác nhau nin
LÕ lẽ là do số lượng mầu điều tra của chúng lôi còn ít. Ràl có thê tí lè niiy
không chỉ dứng ờ con sổ 1/6. Nếu tiến hanh điều tra diện rộng 1 Tên IAI c;i các
nguồn vi sinh vật lliì có Ihể còn Cíio hơn nữa. Như vậy, các nghiên cứu đã
chứng 1Ỏ rã nu số lượng các vi sinh vật phân lập ở Việ! Nam có chứa RR không
nhiii là ÍI. và sẽ là nguồn cung cấp RE phong phủ cho những nghiên UIII và ứng
dụng RE sau này. Chúng tôi chọn chủng vi khuẩn 5 làm dối tưựng nghiên cứu
cho các thí nghiệm liếp theo.
2.1.3. Nghiên cứu sủ (lụng li/o/im phá màng tê l>ào vi khuẩn
2.1.3.ì. Xác dịnh nóng độ liz.oziin thích hợp
2.ì 3 .1 .Ị. Dòì với các enzim chuẩn
Để tìm hiếu anh hướng của lizozim lên các en/.im giới hạn cluiiiii. cluing
lòi (in hò lií thí nghiệm clùim lỉmd ỈÍI cắt ADN )- trtinii sự có mặt cua li/n/im
ờ CÌÍC Iiổng dọ khúc nhíUi đùng dể pluí màng tè hào vi kluiấn.
-17-
Qua kết quả cho thấy, nếu nồng độ lizozim 0,10 - 0.15 mg/ml có trong
hỗn hợp cắt của Hind III không ảnh hưởng đến kết quá. Nhưns ờ nồng độ
lizozim 0,2 và 0,3 mg/ml thì đã cắt nhỏ ADN Ằ. (hình 2 )
1 2 3 4 5
Hình 2. Phổ điện di ADN X cắt bởi enzim giới hạn Hind III có lizozim
1 -
ADN Ã + Hind III +Hzozitn 0,3 mghnì
2 -
ADN Ả + Hind /// +lizozim 0,2 mghiìl
3 -
ADN À + Hind III +iizozim 0,15 mg/ml
4 -
12- ADN Ả + Hind ///
- Với chúng OTB.
Khi sứ dụng enzim giới hạn thô của tế bào chủng OTB phá vỡ bãng siêu
âm và khi phán ứng có sự thêm lizozim nồng đô 0,15 mg/ml cho thấy ớ nổnơ
độ này không ánh hướng đến enzim giới hạn của chủns OTB đến sự cát ADN
Ả và ADN T7 (hình 4).
-20-
12 3 4 5 6 78 9 10 11 12
Hình 4. Phổ điện cii ADN được cắt bới enzim giới hạn thỏ cua chung OTB có
Iizozim 0,15 mg/inl
I - 4: AD N Ả + enzim iỊÌỚi hạn thô
ỉ , II: Đôi chúng khôn W có ADN
6 - 10: AD N T7 + enzim ý ới hạn thô
12: Mau chuẩn
2.1.4. Xác định độ phá vở tế bào bâng lizozim với nóng độ 0,15
nig/ml
Đê tìm hiểu phá màng tế bào VI khuẩn hằng lizozim. chúng tói dựa vào
sự thay đổi chỉ s ô OD và đêm Nỏ lượng lẽ bào .
Copyright: Tài liệu đại học ©