PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) là một polyme tự nhiên có các tính
chất sinh hóa học quan trọng như có khả năng hòa tan trong nước, phân hủy
sinh học, không độc và ăn được. γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong ngành
công nghệ thực phẩm, dược phẩm sinh học, y tế, mỹ phẩm, xử lý môi trường
và các lĩnh vực khác (Shih et al. 2001).
γ-PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram
dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản
phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis
Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al. 2001), Thua-nao từ Thái
Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc.
Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên men
truyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được các
chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao đó là Boza.
Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm
từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %,
có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng. Trong
boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như:
Lactobacillus brevis subsp. lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus
faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus
pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp. và Lactobacillus
paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al. 2011). Hệ vi sinh vật trong Boza lên
men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có
khả năng tổng hợp γ-PGA.
Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA, các nhà nghiên cứu không
ngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên. Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và
đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống

glutamate và 20-50% là L-glutamate (Kubota et al. 1993). Nhiều yếu tố cũng
ảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA. Nồng độ của Mn
2+
có
thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA được tổng hợp bởi
Bacillus subtilis. Khi môi trường có nồng độ Mn
2+
cao thì trong γ-PGA có
đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn
2+
thấp thì γ-
PGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% (Thorne et al. 1958).
2.1.2. Tính chất vật lý
Bảng 2.1. Tính chất vật lý, hóa học của gamma-polyglutamic acid
Công thức phân tử (C
5
H
7
NO
3
) n
Công thức cấu tạo
Trọng lượng phân tử
50 kDa - 2000 kDa tùy mức độ trùng hợp
khác nhau
Tên gọi khác nhau
- Gamma-polyglutamic acid (γ-PGA)
- Axit gamma polyglutamic
- Gamma polyglutamate
- Poly [imino [1-carboxy-4-oxo-1, 4-butanediyl]]

carboxyl tạo điểm gắn cho hóa trị liệu, do đó khiến thuốc hòa tan nhiều hơn
và dễ dàng kiểm soát hơn. Liên kết γ-PGA và thuốc có thể xâm nhập vào vị
trí khối u và giải phóng thuốc, sau đó γ-PGA bị phân hủy thành acid glutamic
có thể thâm nhập vào quá trình trao đổi chất của tế bào và được bài tiết qua
thận (Li et al, 1998).
Enzym là chất xúc tác sinh học thường dễ bị ảnh hưởng bởi các tác
nhân môi trường trong đó có các tia phóng xạ (Dengyi et al.,1993; Saha et
al.,1995). Để giảm thiểu các tác nhân và nâng cao hiệu quả sử dụng enzym.
Enzym thường được kết hợp với các chất gắn, hay các hợp chất bảo vệ khác
nhau để tránh khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Mỗi loại
hợp chất dùng để gắn enzym đều có những ưu và nhược điểm riêng (Dengyi
et al.,1993; Saha et al.,1995). Hiện nay γ-PGA đang được nghiên cứu để gắn
vào enzym do chúng có ưu điểm là có thể phân hủy sinh học, không ảnh
hưởng tới môi trường)(Miyachi et al.,1996; Sakamoto et al.,1997). Ở Việt
Nam chưa có nhiều các nghiên cứu về ảnh hưởng của các tia bức xạ đến
enzym, cũng như vai trò của γ-PGA trong việc bảo vệ hoạt tính enzym chống
lại các tác nhân do các tia bức xạ gây nên.
b) Chất kết dính sinh học
Chất kết dính sinh học được sử dụng trong việc cầm máu, gắn kết các
vết rò rỉ khí ở phổi, chống lại sự bám dính giữa tế bào bình thường với lớp mô
bị tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật. Các chất kết dính phẫu
thuật hiện tại đang được sử dụng như fibrin nhưng có độ bám dính mô kém.
Otani và cộng sự 1999 đã cho rằng liên kết giữa gelatin và γ-PGA có thể thay
thế cho các chất kết dính có nguồn gốc fibrin và có hiệu quả hơn trong việc gắn kết
vết rò rỉ trên phổi so với chất kết dính có nguồn ngốc từ fibrin (Otani et al. 1999).
c) Chất mang gen chuyển
Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA
tương đối ổn định đối với albumin huyết thanh. γ-PGA dễ dàng tạo ra các liên
kết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm như
vậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase. γ-PGA mang

2+
(thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng
sắt để tạo thành hemoglobin và hồng cầu), Mg
2+
(tác dụng ức chế các phản
ứng thần kinh và cơ)…tạo muối tan giúp cơ thể tăng tốc độ hấp thụ các chất và
khoáng chất trong ruột non giúp cho cơ thể hấp thụ tối các chất dinh dưỡng cung
cấp khoáng chất cho cơ thể (Tanimoto et al., 1995 ).
Tanimoto và cộng sự năm 2007 đã chứng minh ngay cả phụ nữ sau
mãn kinh khi dùng γ-PGA còn giúp cho cơ thể hấp thụ canxi tốt qua ruột non
giúp ngăn cản quá trình hình thành calcium phosphate không tan, tình trạng
thiếu canxi trong máu hỗ trợ chứng mất chất khoáng ở trong xương, loãng
xương, còi xương và thiếu Ca tăng trưởng. (Tanimoto et al, 2007.)
2.1.3.3.Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm
γ-PGA có thể được sử dụng như một thành phần nâng cao tính chất
của các sản phẩm chăm sóc da hoặc như một loại kem dưỡng ẩm, tẩy tế bào
chết và loại bỏ nếp nhăn. Tính chất của γ-PGA tương đối đồng nhất, ổn định
về mặt hóa học nên thường được sử dụng là thành phần trong các loại kem
dưỡng da (Ben-Zur and Goldman, 2007). γ-PGA bổ sung vào sản phẩm có tác
dụng làm mịn da, đàn hồi, tự giữ ẩm và tạo độ mềm mại cho da. γ-PGA liên
kết với chất Aloe veraor chiết xuất từ cây lô hội đã được nghiên cứu làm tăng
lượng acid pyrolidonecarboxylic (là thành phần thiết yếu cho da) trên lớp biểu
bì dưới da mà không làm ảnh hưởng đến sự cân bằng của da. γ-PGA còn giúp
phục hồi tóc sau quá trình tẩy màu tóc và nhuộm tóc bằng cách tăng khả năng
giữ ẩm và hình thành một hàng rào bảo vệ giúp tóc giữ được màu (Ben-Zur
and Goldman, 2007).
γ-PGA còn làm ức chế enzyme hyaluronidase giúp acid hyaluronic
không bị phân hủy, cùng với collagen là những thành phần thiết yếu của da. γ-
PGA có khả năng hấp thụ nước nên nó có tác dụng làm ẩm da, sáng da, làm
đầy nếp nhăn và chống lão hóa, tăng độ đàn hồi da cao hơn collagen. γ-PGA

gia cầm, giúp tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, tăng sản lượng
trứng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi giúp cho ngành
chăn nuôi đạt hiệu quả cao nhất (Shih et al., 2001; Tanimoto et al., 2007).
2.1.3.6. Trong lĩnh vực nông nghiệp
Năm 2007, King và cộng sự đã nghiên cứu một loại phân bón chứa γ-
PGA giúp cho cây trồng phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh
dưỡng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản
lượng và chất lượng. γ-PGA được sử dụng làm phân bón và cải tạo đất, bảo
quản hạt giống, kiểm soát độ ẩm làm tăng chất lượng và sản lượng cho nông
sản (King et al. 2007).
Kết quả rõ rệt khi sử dụng phân bón chứa γ-PGA và không sử dụng phân
bón chứa γ-PGA của 2 giống sắn
Bảng 2.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón chứa γ-PGA tới
2 giống sắn KM140 và KM 94
Giống
Số cây khảo sát
Trọng lượng trung bình
của củ
Tỉ lệ % trọng
lượng của củ
trên cây bón
PGAvà không
bón PGA
Bón PGA
Không bón
PGA
Bón PGA
Không bón
PGA
KM140 8 cây 8 cây 362,5 g 185,6 g 195 %

Kết tủa Cu
2+
γ – PGA
Lên men hang loạt
Ly Tâm
(7800xg,15phút ,15
o
C)
Tế bào-dịch
Trộn (RT:15phút)
Ethanol: 4
o
C
Ly tâm
Hòa tan kết tủa
Bổ sung dung dịch đệm
Ly tâm
Phân tách
Lọc
Kết tủa γ –PGA
Kết tủa PGA
Sấy khô
γ – PGA tinh khiết
Theo phương pháp của Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis (2010)
cho thấy hiệu quả của phương pháp kết tủa bằng đồng sunfat (85%) hơn hẳn
phương pháp kết tủa bằng ethanol (82%). Vì phương pháp etthanol kết tủa
lượng protein là 48%, trong khi ở đồng sulfate chỉ có 3% protein điều đó chứng
tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng đồng sulfate tinh sạch tốt hơn, không bị lẫn
tạp so với phương pháp kết tủa ethanol (Manocha and Margaritis 2010).
2.2. Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid

trong quá trình trao đổi chất, nitrate (-), di động (+), hiếu khí (+) và âm tính
với thử nghiệm sinh indol.
Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus
2.2.2. Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic
acid
Một số nhà khoa học đã chứng minh chỉ có một vài vi khuẩn, chủ yếu
là chủng vi khuẩn Bacillus như B. subtilis 168, B. subtilis natto, B.
licheniformis, B. anthracis và S. epidermidis là có gen để tổng hợp nên γ-
PGA, trong đó có 2 loài B. anthracis và B. subtilis có gen đặc trưng mã hóa
để tổng hợp lên polyglutamate.
Vi khuẩn B. anthracis, có 4 gen capB, capC, CapA và CapE , mã hóa
cho 1 chuỗi peptide gồm 47 amino acid để tổng hợp polyglutamate
(Candela et al , 2005a.).
Vi khuẩn B. subtilis có 3 gen liên quan tới sự tổng hợp polyglutamate
đó là pgsB, pgsC và pgsAA (Ashiuchi et al.,1999).
Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA dưới sự tham gia của các gen
tương ứng ở mỗi chủng Bacillus
γ-PGA được tổng hợp dưới dạng tự do hay dưới dạng liên kết tùy thuộc
vào gen tổng hợp (Candela et al ., 2005a)
- Nếu PGA được sinh ra và kết hợp với bề mặt vi khuẩn và tạo thành
một lớp vỏ bao quanh vi khuẩn (gồm γ-PGA và liên kết hóa trị liên kết với
peptidoglycan) thì gen tổng hợp PGA là gen cap
- Nếu PGA được sinh dưới dạng tự do thì gen tổng hợp γ-PGA là gen pgs.
2.2.3. Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn
Năm 2007 Shi và cộng sự nghiên cứu và xác định các enzyme tham gia vào
con đường tổng hợp sinh hóa làm tăng hàm lượng γ-PGA (Shi et al. 2007).
Con đường để tổng hợp γ-PGA là từ L-glutamic acid, acid citric và
ammonium sulfate trong B.subtilis IFO 3335 (Kunioka et al., 1997), vì lượng
L-glutamic acid rất ít nên nó có thể được coi như là L-glutamic acid được
tổng hợp từ acid citric thông qua acid isocitric và acid 2-oxoglutaric trong chu

glutamic aid: pyruvic acid aminotransferase; 6 PGA polymerase.TCA axit
tricarboxylic)( Kunioka et al. 1997)
2.3. Boza- nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus
Hình 2.7: Sản phẩm Boza
Boza là một đồ uống có nguồn gốc cổ xưa ở vùng Lưỡng Hà từ 8000-
9000 năm trước. Bắt đầu từ thế kỷ 13, với cuộc xâm lược đế quốc Ottoman
của Anatolia, Thổ Nhĩ Kỳ đã biết tới Boza như một thức uống quen thuộc
được lên men từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp dưới 1% có
vị ngọt và chua. Boza giành được sự công nhận ở nhiều quốc gia là đồ uống
không cồn và được sử dụng nhiều so với tất cả các loại đồ uống không chứa
cồn khác (Kivanc et al. 2011). Boza không chỉ được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ
mà còn được tìm thấy ở nhiều nước khác nhau như là Albania, Bosnia và
Herzegovina, Bulgaria…Boza ở mỗi vùng miền lại mang những hương vị
khác nhau đặc trưng cho vùng sản xuất.
Ở Albania, Boza có truyền thống được sản xuất ở Kukes phía đông bắc
của đất nước này. Nó bao gồm bốn thành phần: ngô, bột mì, đường và
nước. Boza Albania khác Boza sản xuất tại các khu vực khác, là thành phần
chính của nó là ngô và có vị chua, trong khi ở các nước khác như ở Thổ Nhĩ
Kỳ, Bulgaria, và Macedonia, thành phần chính thường là kê, lúa mạch hoặc
đậu xanh. Boza Albania có màu vàng kem nhẹ, có vị ngọt chua mang đặc
trưng của vùng, Bulgaria có vị nhạt, loãng và có chất lượng thấp vì vậy Boza
ở Bulgaria người ta tăng độ ngọt bằng cách bổ sung thêm chất ngọt nhân tạo
khác. Cộng hòa Macedonia, Boza loãng và thiếu vị ngọt của đường, còn ở
Romania thì Boza ngọt hơn ở Thổ Nhĩ Kỳ và Bulgaria, nhưng đặc hơn và sẫm
màu hơn so với Cộng hòa Macedonia. Ở Serbia, Boza nó thường được làm bằng
nước, bột mì, bột ngô, men và đường. Boza được bảo quản trong những điều
kiện, ở nhiệt độ từ 2 – 3
o
C, đồ uống có thể được bảo quản lên đến một tháng.
Năm 2011, Merith Kivanc và cộng sự đã chứng minh là có khoảng 45

PGA vào trong nước như là tác nhân tuyển nổi (vừa là chất đông đặc vừa là
chất tạo bọt) với điều kiện tối ưu, với khối lượng các thành phần trong nước là
khối lượng 0,5 % γ-PGA, 0,1% than hoạt tính, tốc độ sục khí 4L min
-1
,trong
thời gian 30 phút, pH ban đầu là 7. Không khí được sục vào nước sẽ tạo ra bọt
khí, PGA mang các hạt than hoạt tính lên trên bề mặt. Ngoài ra hàm lượng chì
(Pb) trong nước có thể giảm xuống do sự hấp phụ của chúng vào than hoạt tính
vì vậy có thể loại bỏ cả chì và than hoạt tính ra khỏi dung dịch. Sự kết hợp của
than hoạt tính và γ-PGA trong quá trình tuyển nổi là một phương pháp mới có
thể loại bỏ chì trong nước với hiệu quả là 90% lượng Pb trong nước.(Lê Phước
Cường và cộng sự, 2013).
2.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 2003, ngành công nghệ sinh học Nhật Bản đã đạt được giải vàng
về nghiên cứu ứng dụng của γ-PGA trong ngành công nghệ mỹ phẩm, là sản
phẩm sinh học tổng hợp tự nhiên và chiết xuất từ một loại thực phẩm truyền
thống của Nhật có tên gọi là Natto, ra đời trên 800 năm. Natto được sản xuất
từ đậu nành lên men bằng trực khuẩn Bacillus subtilis Natto. Natto chứa các
vitamin B2, B6, B12, E, K2. γ-PGA được chiết xuất từ phần chất keo nhớt
chứa trong Natto.
Bác sĩ David Harrison - Trường Đại học North Durham nước Anh,
chuyên gia nghiên cứu về tác dụng của oxy đối với da xác định “Chính không
khí và môi trường chung quanh đã cung cấp oxy vào da đến một độ sâu đáng
kể”. Điều này mở ra triển vọng ứng dụng γ-PGA hiệu quả trong việc trị khô
da. Công nghệ điện chuyển ion γ-PGA của Nhật phối hợp với công nghệ điện
chuyển ion vitamin C + E, các công nghệ Laser, công nghệ Oxyjet, công nghệ
sóng RF, công nghệ Botox, Restylane… sẽ giúp làn da khỏe mạnh và luôn giữ
được vẻ mịn màng tươi sáng, săn chắc, trẻ trung
Năm 2007, Tanimoto đã nghiên cứu γ-PGA làm tăng lượng canxi (Ca)
hòa tan cơ thể, và các nghiên cứu có liên quan tới tình trạng thiếu caxi trong

2+
và
Al
3+
) từ nước thải công nghiệp. Nghiên cứu phát triển màng vi lọc với γ-PGA
liên kết hóa trị, γ-PGA được tổng hợp từ B. licheniformis ATCC 9945 có khả
năng hấp phụ đồng rất tốt là 77,9 mg/g ở nồng độ 32 mg /l ở pH 4.0 và 25
o
C
(Mark et al., 2006). Năm 2009, Inbaraj và cộng sự đã chứng minh γ-PGA
cũng liên kết rất chặt chẽ với ion hóa trị hai như thủy ngân (Hg
2+
), ion chì
(Pb
2+
), chính nhờ khả năng tạo kết phức với các ion hóa trị hai này mà γ-PGA
được coi như một chất hấp thụ đầy hứa hẹn để loại bỏ các kim loại nặng trong
quá ô ngiễm nguồn nước. γ-PGA còn là một vật liệu hấp phụ thích hợp cho
việc loại bỏ các BB9 thuốc nhuộm cơ bản và BG4 từ dung dịch nước. Quá
trình hấp thụ xảy ra đã nhanh chóng đạt hiệu quả cao, an toàn và không gây
độc hại. Khoảng 98% số thuốc nhuộm hấp phụ trên γ-PGA có thể được phục
hồi và có khả năng tái sử dụng (Inbaraj et al., 2009).
Một số nhà nghiên cứu chỉ ra rằng γ-PGA có thể hấp thụ Hg (II), Cr
(III), Ni (II) và thuốc nhuộm cơ bản. Crom tồn tại trong nguồn nước ở cả hai
dạng hóa trị sáu và hóa trị ba, trong nước uống Cr (III) hiếm khi gặp mà chủ
yếu là Cr (VI). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Cr (VI) là gây ung thư nếu
hít phải hay tiếp xúc vì vậy PGA được nghiên cứu như một chất hấp phụ để
loại bỏ Cr (VI), Cr (VI) được hấp thụ mạnh ở pH thấp, với nồng độ PGA cao
thì hiệu quả loại bỏ Cr (VI) được nâng cao. Trong nghiên cứu này số lượng
hấp thụ Cr (VI) cao nhất với khối lượng γ-PGA là 21,4 mg /g, kết quả này tuy

PO
4
Mỹ Dầu soi Trung Quốc
CH
3
COONa Trung Quốc NaCl Trung Quốc
MgSO
4.
7H
2
O Trung Quốc NaOH Trung Quốc
Tryptone Trung Quốc CaCO
3
Việt Nam
Ethanol 96% Việt Nam
3.3.2. Thiết bị sử dụng
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ
Nồi hấp
thanh trùng
Trung Quốc Cân phân tích Anh
Tủ sấy Đức Máy khuấy từ Đức
Tủ ấm Trung Quốc Máy đo pH Nhật
Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức
Máy ly tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn quốc
Máy lắc Hàn quốc Tủ lạnh Nhật
Máy Voxted Đức Lò vi sóng Mỹ
Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiêm bao gồm:
micropipette 10-100μl, 100-1000 μl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy,
que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,….