4
MỤC LỤC
Trang
Mở đầu
1
Chƣơng 1. Tổng quan
1.1. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm và nhu cầu phát triển công
cụ phân tích nhanh
4
1.1.1. Nguyên tố asen trong tự nhiên và đời sống
4
1.1.2. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan trên thế giới và
ở Việt Nam
6
1.1.3. Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho
nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nước giếng
khoan
10
1.2. Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen trong
nước
14
1.2.1. Biosensor sử dụng các tế bào vi khuẩn
14
1.2.2. Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen và có gắn các
gen chỉ thị khác nhau
và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở
người
28
Chƣơng 2. Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
34
2.1. Nguyên liệu
34
2.1.1. Mẫu nước giếng khoan, mẫu tóc và mẫu nước tiểu
34
2.1.2. Mẫu biosensor sử dụng các chủng vi khuẩn chỉ thị
36
2.1.3. Thiết bị, hoá chất và chất chuẩn
37
2.2. Phương pháp
38
2.2.1. Nuôi, cấy chuyển và giữ giống vi khuẩn chỉ thị asen
38
2.2.2. Phân tích hàm lượng asen hoà tan trong dung dich trung tính
bằng vi khuẩn chỉ thị
38
2.2.3. Thí nghiệm chọn thời gian vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB tiếp
xúc với asen và tối ưu hoá lượng cơ chất n-decanal.
40
2.2.4. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng sắt trong nước
tới khả năng sử dụng sinh học asen đối với vi khuẩn chỉ thị
40
2.2.5. Phương pháp phân tích asen trong dung dịch bằng quang phổ
hấp thụ nguyên tử nối ghép thiết bị sinh khí hydrua asin
(AsH
3
65
3.2.1. Mức độ tích luỹ asen trong các mẫu tóc
65
3.2.2. Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,
nước đã lọc với hàm lượng asen trong tóc
73
3.2.3 Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,
nước đã lọc với hàm lượng các dạng asen methyl hoá trong
nước tiểu
76
Kết luận
84
Kiến nghị về các nghiên cứu tiếp theo
85
Tài liệu tham khảo
86
Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan tới luận án
97 7
8
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1 Mối quan hệ giữa biomarker và bioindicator
Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá các chất độc trong cơ thể
Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết về chuyển hoá của asen trong cơ thể người
Hình 2.1 Bản đồ các vị trí lấy mẫu sinh học
Hình 3.1 Kết quả thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen trong nước bằng vi
khuẩn chỉ thị E. coli lacZ
Hình 3.2 Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang kết quả thí nghiệm đánh giá
hàm lượng asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị E. coli gfp
Hình 3.3 Tương quan giữa cường độ ánh sáng phát ra và nồng độ asen trong
dung dịch khi thử nghiệm với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với asen lên cường độ ánh sáng phát
ra ở phản ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.5 Ảnh hưởng của lượng cơ chất n-decanal lên cường độ ánh sáng phát
ra
Hình 3.6 Ảnh hưởng của lượng sắt trong dung dịch lên khả năng sử dụng sinh
học asen đối với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.7 So sánh tác dụng của các hoá chất tới khả năng sử dụng sinh học asen
đối với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.8 Ảnh hưởng của lượng EDTA lên cường độ ánh sáng phát ra ở phản
ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB.
Hình 3.9 Cường độ ánh sáng phát ra ở phản ứng xúc tác bởi enzym luciferase
của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB khi dùng dung dịch NaOH và
Natri Pyrophotphat 200mM
10MỞ ĐẦU
Đảm bảo chất lượng nước ăn và nước sinh hoạt cho cộng đồng dân cư
tại khu vực nông thôn là một trong những vấn đề trọng tâm của chương trình
chăm sóc sức khoẻ ban đầu hiện nay tại Việt Nam. Đồng bằng sông Hồng và
đồng bằng sông Mê kông là hai khu vực tập trung đông dân nhất nước ta với
dân số tương ứng 17,7 triệu và 16,9 triệu, chiếm gần 42,7% trong tổng số
khoảng 80,9 triệu dân của cả nước (theo số liệu điều tra dân số năm 2003 của
Tổng cục Thống kê). Ngoại trừ tại các thành phố, thị trấn có hệ thống cấp
nước sạch tập trung từ các nhà máy nước, còn lại hầu hết dân cư sống xa đô
thị đều phải tự khai thác và sử dụng các nguồn nước khác như nước mặt
(nước sông, hồ), nước ngầm (nước giếng khơi, giếng khoan), nước mưa. Để
tránh một số bệnh như tiêu chảy, đau mắt, giun sán, v.v…do sử dụng nước
sông, nước hồ gây ra, ngày nay hầu hết các hộ dân tại hai khu vực trên đã tự
khoan giếng để lấy nước ngầm sử dụng cho các sinh hoạt hàng ngày như ăn
uống, tắm giặt [5]. Nhưng người dân lại có nguy cơ đối mặt với một ô nhiễm
mang tính tự nhiên, đó là sự có mặt của nguyên tố asen (thạch tín) trong nước
nguyên tắc sinh học là hướng đi mới của các nhà khoa học trên thế giới.
Để phát triển phép đo asen nhanh, một số biosensor dựa trên vi khuẩn
chỉ thị asen đã được thiết kế trong phòng thí nghiệm nhờ việc lắp ghép gen
cảm ứng đặc hiệu asen với gen chỉ thị tạo ra tín hiệu đo được [15, 74, 82, 85].
Tuy nhiên độ tin cậy, khả năng ứng dụng thực tiễn để phân tích asen trong
nước giếng khoan vẫn chưa được thử nghiệm, nhất là khi khả năng sử dụng
sinh học asen (bioavailability) đối với vi khuẩn chỉ thị bị giảm đi bởi các
thành phần hoá học khác trong nước.
Để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen ở người, các biomarker như hàm
lượng asen trong tóc, hàm lượng các dạng asen hữu cơ bài tiết trong nước
tiểu được sử dụng khá phổ biến. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm đã 12
được phát hiện tại Việt Nam nhưng số lượng công trình công bố về sự thâm
nhiễm asen trong quần thể có phơi nhiễm asen do dùng nước giếng khoan
vẫn còn rất hạn chế.
Để góp phần vào việc triển khai ứng dụng công cụ phân tích asen bằng
biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị asen biến đổi gen, đánh giá mức độ thâm
nhiễm asen ở người và đề xuất giải pháp giảm thiểu nhiễm độc asen, luận án
đã được thực hiện với chủ đề: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ HÓA
SINH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ Ô NHIỄM ASEN TRONG NƢỚC GIẾNG
KHOAN VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI THÂM NHIỄM ASEN TRÊN NGƢỜI”,
gồm hai mục tiêu sau:
1. Chọn lựa và tối ƣu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng asen trong
nƣớc giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
2. Đánh giá mối tƣơng quan giữa ô nhiễm asen trong nƣớc giếng
khoan với mức độ thâm nhiễm asen trên ngƣời
cao As(V) sẽ là dạng bền hơn [78, 97].
Asen có mặt trong hơn 200 loại khoáng khác nhau với nồng độ trung bình
khoảng 2mg/kg. Phổ biến nhất là các asenopyrit như orpiment As
2
S
3
, realgar AsS,
mispikel FeAsS, loellingite FeAs
2
, nicolite NiAs, cobalite CoAsS, tennantite
Cu
12
As
4
S
13
, v.v… Từ các quặng này, quá trình phun trào núi lửa đã chuyển asen từ
đất vào không khí. Việc khai thác mỏ cũng rửa trôi các muối asen trong quặng và
gây ô nhiễm asen trong nước mặt tại các khu vực xung quanh mỏ. Trong tầng nước
ngầm, quá trình hoà tan asen xảy ra theo cơ chế khử, tạm thời được giải thích như
sau: các phản ứng sinh học, hoá học diễn ra trong lòng đất đã tiêu hao ôxy và tạo
nên môi trường mang tính khử. Sắt (III) - dạng kết tủa trong quặng sẽ chuyển thành
sắt (II) - dạng dễ tan trong nước. Quá trình này đồng thời làm cho asen rời khỏi
quặng sắt và tan trong nước ngầm. Một số khu vực đồng bằng thấp trũng, thường
xảy ra lụt lội là nơi nước ngầm thiếu ôxy và có thế khử thấp (Eh < 100mV), ví dụ
như Bănglađet, đồng bằng sông Gange, Ấn Độ, đồng bằng sông Hồng, Việt Nam.
Và cũng chính tại đây, ô nhiễm asen trong nước ngầm đã được phát hiện trong thập
kỷ vừa qua [13, 60, 78].
Trong công nghiệp, asen được tạo ra nhờ quá trình khử ôxyt asen (As
2
asenocholine, asenobetain.
Nồng độ asen trung bình trong không khí tại các vùng nông thôn, xa khu
công nghiệp nằm trong khoảng 0,02- 4 ng/m
3
, tại đô thị khoảng 3-200 ng/m
3
, còn ở
các khu công nghiệp và vùng lân cận có thể lên tới 1000 ng/m
3
, đặc biệt ở các khu
công nghiệp luyện kim màu [97].
Trong phần trên của nước biển, asen có mặt với nồng độ khoảng 1-2 µg/l.
Hàm lượng asen cũng thấp khoảng 10 µg/l ở vùng nước bề mặt như sông, hồ. Tuy
nhiên, khi ở gần nguồn phát thải ô nhiễm như các vùng mỏ, nhà máy luyện kim thì
lượng asen trong nước bề mặt có thể cao tới 5 mg/l. Thông thường, asen có mặt
trong nước ngầm với nồng độ khoảng 1-2 µg/l, trừ các khu vực có núi lửa, có quặng 15
sulfit thì có thể lên tới 3 mg/l. Nước ngầm tại các vùng đồng bằng trầm tích trẻ có
thể chứa asen tới vài trăm µg/l.
Trong đất, asen thường có mặt với hàm lượng khoảng 1 - 40 mg/kg, trong
bùn lắng khoảng 5 - 3000 mg/kg, các mẫu bùn đất càng ở gần vùng ô nhiễm thì hàm
lượng asen càng cao [78].
Các sinh vật biển thường chứa asen trong khoảng 1-100 mg/kg và chủ yếu là
asen hữu cơ như asenobetain, asenosugar, trimethylasin, v.v Lượng asen trong cá
nước ngọt thường nhỏ hơn cá biển và ở khoảng 1 mg/kg. Các động vật giáp xác như
tôm, cua, sò cũng chứa asen hữu cơ [97].
Trong cuộc sống, con người tiếp xúc với asen qua không khí, nước uống và
Quốc, Ấn Độ, Bănglađet, Nêpan, Myanma, Việt Nam, v.vv… Số lượng các địa
điểm được coi là có nguồn nước ngầm ô mhiễm asen hiện vẫn gia tăng, nhất là khi
chỉ số asen trong nước ngầm trở thành tiêu chuẩn xét nghiệm của các cơ sở cung
cấp nước sạch. Bảng 1.1 trình bày số liệu về tình hình ô nhiễm asen tại các nước
Đông Á, một trong những khu vực đông dân và kém phát triển nhất thế giới [59,
77].
Bảng 1.1 Ví dụ hiện trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm tại một số quốc gia
trên thế giới [59, 77]
Tên nƣớc
Số dân chịu ảnh
hƣởng (triệu)
Khoảng nồng độ asen
trong nƣớc ngầm (µg/l)
Năm phát
hiện
Achentina
2
100 - 1000
1981
Bănglađet
50
<1 – 4700
1980
Ấn Độ
1
<1 – 3900
1980
Trung Quốc
2004 cho thấy, tám tỉnh thuộc Trung Quốc lục địa với hơn 2 triệu người đã thâm
nhiễm asen từ nước giếng khoan, hàm lượng asen nằm trong khoảng 50 – 2000 µg/l.
Trong số đó 10 nghìn người được chẩn đoán là mắc các bệnh liên quan tới asen
[98].
Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy vấn đề ô nhiễm asen trong nước
giếng khoan và nguy cơ tác hại tới sức khoẻ người dân là rất lớn kể cả diện tích và
số người chịu ảnh hưởng. Hơn thế nữa, đối tượng dùng nước giếng khoan thường là
nông dân ở vùng nông thôn , cơ sở hạ tầng kém phát triển, nhận thức về an toàn vệ
sinh nước ăn uống chưa cao. Chính vì vậy, nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm và
đề xuất các giải pháp giảm thiểu asen là những vấn đề cần được giải quyết triệt để
càng sớm càng tốt [6].
Ô nhiễm asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam
Trong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, UNICEF đã hỗ trợ chính phủ các
nước nghèo giúp người dân tiếp cận với các nguồn nước sạch hơn để giảm tỉ lệ ốm
đau do sử dụng nguồn nước kém vệ sinh. Một trong những nguồn nước được coi là
sạch hơn này là giếng khoan bơm tay. Cũng nhờ vào các hoạt động nhân đạo này,
vào những năm 1990 người dân nông thôn Việt Nam tại một số vùng đã được lắp
đặt các giếng khoan để lấy nước sạch dùng cho sinh hoạt hàng ngày. Tổng số giếng
do UNICEF hỗ trợ tại Việt Nam là khoảng 150.000 chiếc, tuy nhiên số lượng giếng
khoan bơm tay và bơm điện hiện có đã lớn hơn rất nhiều. Con số tạm ước tính có 18
khoảng 20,48% dân số Việt Nam (16,5 triệu người) đang dùng nước giếng khoan
[6].
Theo quy định của Nhà nước Việt Nam ban hành năm 1995 về môi trường,
giới hạn cho phép của asen trong nước ngầm và nước mặt dùng cho mục đích sinh
hoạt là 0,05 mg/l (50µg/l). Năm 2002, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành tiêu chuẩn vệ
19
ngang như Bănglađet với 62,1% số mẫu vượt 50 µg/l, tại Hà Tây 24,7 % số mẫu có
hàm lượng asen cao hơn 50 µg/l. Cũng theo tổng kết của tổ chức này, cho đến nay ở
Việt Nam chưa có những ca bị nhiễm asen được báo cáo chính thức. Tuy nhiên đã
có 8 người được đưa vào danh sách những bệnh nhân bị nghi mắc bệnh nhiễm asen
[6]. Như vậy vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan dùng cho sinh hoạt tại
nông thôn Việt Nam là một thực trạng đáng lo ngại. Tuy nhiên quy mô, mức độ ô
nhiễm trên toàn quốc vẫn chưa được điều tra đầy đủ.
1.1.3. Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho nhiệm vụ đánh
giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nƣớc giếng khoan
Như đã trình bày ở phần trên, ô nhiễm asen trong nước giếng khoan là thực
trạng đáng lo ngại ở cả Việt Nam và các nước khác trong khu vực Đông Nam Á với
quy mô tác hại rất lớn kể cả diện tích và số người chịu ảnh hưởng. Sau khi thảm hoạ
môi trường do asen gây ra tại Bănglađet và Ấn Độ được phát hiện, các tổ chức
chính phủ, phi chính phủ đã bắt tay vào cuộc nhằm tích cực giảm thiểu ảnh hưởng
của sự cố này. Một trong những mục tiêu của chính sách giảm thiểu nhiễm độc asen
là phải xác định hàm lượng asen tại tất cả các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt
càng sớm càng tốt, để có biện pháp xử lý kịp thời. Tại Việt Nam, Tiểu ban chỉ đạo
quốc gia về giảm thiểu asen đã được thành lập tháng 10 năm 2002 trực thuộc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tiểu ban này đã đề xuất kế hoạch hành động
gồm 5 mục tiêu trong đó có mục tiêu xây dựng hệ thống cơ sở dữ liệu và lập bản đồ
những khu vực bị ô nhiễm asen vượt trên tiêu chuẩn quốc gia. Các nhiệm vụ khảo
sát ngẫu nhiên, khảo sát đại trà, khảo sát thường xuyên có nhiệm vụ cung cấp dữ
liệu cho mục tiêu nói trên. Tuy các chương trình quốc gia về asen đã bắt đầu hoạt
động, nhưng hiện nay cơ sở dữ liệu mang tính đại diện, hệ thống về ô nhiễm asen
vẫn chưa có. Các kết quả điều tra mới chỉ tập trung vào một số xã, huyện cụ thể, nơi
MS)
Trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn, các phương pháp trên đều đạt được
giới hạn phát hiện asen nhỏ hơn 10 µg/l [8] và đáp ứng nhiệm vụ phân tích asen
trong nước. Tuy nhiên các thiết bị này thường chỉ có ở những phòng thí nghiệm
hiện đại, các trung tâm nghiên cứu lớn. Để đáp ứng nhiệm vụ phân tích, công sức và
chi phí cho việc vận chuyển mẫu từ các tỉnh xa về thành phố là khá lớn. 21
Chính vì vậy, khi phân tích nhiều mẫu tại địa phương với các cán bộ ít kinh
nghiệm thì giải pháp sử dụng công cụ đo hiện trường đơn giản là hợp lý hơn. Hiện
nay các bộ dụng cụ xác định asen hiện trường kiểu hoá học được sử dụng rộng rãi
tại các quốc gia có ô nhiễm asen nặng như Bănglađet, Ấn Độ, Việt Nam, v.v…
Nguyên tắc hoạt động của chúng dựa trên phản ứng giữa khí asin (AsH
3
) và bromit
thuỷ ngân, tạo ra màu vàng. Độ đậm nhạt của màu sắc tỉ lệ với nồng độ asen trong
mẫu, người phân tích so sánh màu tạo ra với bảng màu đối chứng cho sẵn mà kết
luận hàm lượng asen nằm trong khoảng nào. Tuy giới hạn phát hiện được ghi là
khoảng 10 - 50 µg/l nhưng độ tin cậy của phương pháp này vẫn là câu hỏi đáng
quan tâm [48, 65]. Theo báo cáo của Rahman và các cộng sự vào năm 2002, khoảng
1,3 triệu giếng tại Bănglađet đã được kiểm tra với chi phí khoảng 2 đôla cho một
phép phân tích kể cả xử lý số liệu (so với giá 9 đôla cho một phép phân tích bằng
thiết bị hiện đại). Khi so sánh kết quả phân tích chéo 290 mẫu bằng phương pháp
phân tích hiện trường và trong phòng thí nghiệm cho thấy, với vùng nồng độ từ 10 –
100 µg/l, tỷ lệ sai lệch âm là 68%, sai lệch dương là 35%. Kết quả phân tích lại
2966 giếng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử cũng cho thấy trong số 1920 giếng
đã đánh dấu là an toàn (< 50 µg/l asen) thì có tới 862 giếng là không an toàn (> 50
µg/l asen), chiếm 44,9% [65]. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Viện Công nghệ Môi
23
1.2. Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen trong nƣớc
1.2.1. Biosensor sử dụng các tế bào vi khuẩn
Để đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường của một hoá chất độc hại nào đó
người ta có thể sử dụng hoặc các công cụ hoá học hoặc các công cụ cảm biến sinh
học (biosensor). Một biosensor thường bao gồm phần tạo tín hiệu mang bản chất
hoá sinh và phần chuyển đổi tín hiệu đó sang dạng đo lường được. Phần tạo tín hiệu
dựa trên đáp ứng của bộ phận cảm ứng như enzym, kháng thể, chất nhận quang tử,
axit nucleic hoặc các tế bào vi khuẩn với chất cần nghiên cứu. Biosensor đầu tiên
được nghiên cứu bởi Clark năm 1962, chứa glucoseoxidase xúc tác cho quá trình
ôxy hoá glucose thành gluconolacton và hydroperoxyt. Hydroperoxyt chuyển hoá
thành ôxy phân tử và nước, lượng ôxy tạo thành được phát hiện nhờ điện cực platin.
chất cyanit, chủng Moraxella sp. có khả năng phân giải chọn lọc hợp chất p-
nitrophenol đã được dùng làm biosensor để phân tích các hợp chất cyanit và p-
nitrophenol. Các loại biosensor này có cấu trúc gồm các tế bào vi khuẩn định vị trên
màng của điện cực ôxy, sự có mặt của các chất nói trên sẽ được ghi nhận lại nhờ
lượng ôxy tiêu hao cho quá trình phân giải chúng [50, 57]. Để đánh giá mức ô
nhiễm một số kim loại nặng trong đất, nước như asen, đồng, chì, cadmi, người ta có
thể sử dụng chủng vi khuẩn biển có khả năng phát quang sinh học là Vibrio fischeri
(MicroTox®). Độ phát quang của vi khuẩn sẽ giảm tỉ lệ với hàm lượng các kim loại
độc hại. Tuy nhiên dạng biosensor này thường kém ổn định và không có khả năng
nhận dạng đặc hiệu chất gây độc [30].
Sự phát triển của các kỹ thuật chuyển gen đã cho phép tạo ra các chủng vi
khuẩn có khả năng phát hiện chất ô nhiễm môi trường một cách chọn lọc nhờ gắn
kết các gen đáp ứng đặc hiệu với chất ô nhiễm và gen chỉ thị có độ nhạy cao. Ví dụ
tác giả Ikeno và cộng sự đã đưa plasmit pTS301-GFP chứa các gen liên quan tới sự
phân giải benzen và gen chỉ thị gfp vào vi khuẩn E. coli để tạo ra biosensor có đáp
ứng đặc hiệu với các hợp chất nhóm benzen, vi khuẩn chỉ thị biến đổi gen này có
thể phát hiện dẫn xuất xylen ở nồng độ 0,1 mM [45]. Để phát hiện và định lượng
chất kháng sinh tetracycline, các nhà khoa học Đan Mạch đã gắn gen khởi động
cảm ứng tetracycline P
tet
với các gen chỉ chị lacZYA, luxCDABE hoặc gfp và đưa
vào vi khuẩn E. coli. Chủng vi khuẩn biến đổi gen này đã được ứng dụng để xác
định dư lượng tetracycline trong sữa [38]. Xu hướng tạo ra các chủng vi khuẩn biến
đổi gen đã và đang được phát triển nhằm tạo ra các biosensor phát hiện kim loại
nặng nói chung [30, 85] và asen nói riêng [15, 82]. 25
1.2.2. Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen và có gắn các gen chỉ thị
nghiên cứu kỹ hơn cả. Ví dụ plasmit R773 ở E. coli [46], plasmit pI258 ở
Staphylococcus aureus [25], plasmit AIU 301 ở Acidiphilium multivorum [83].
Ở E. coli, operon ars mã cho các tính trạng khử asenat và vận chuyển asenit
nằm ở đoạn plasmit R773 có kích thước 91kb. Operon này hoạt động khi cảm ứng 26
với các nguyên tố hoá học như asen, bitmut, antimony và không làm ảnh hưởng tới
sự thu nhận photphat. Operon ars chứa 5 gen là arsR, arsA, arsB, arsC và arsD.
Gen arsR mã cho protein ArsR điều khiển hoạt động của cả operon ars theo cơ chế
ức chế. Khi không có asen, ArsR liên kết với vùng điều khiển của operon ars và
kìm hãm hoạt động của operon này. Các kim loại như asen, antimony khi thâm nhập
tế bào sẽ gắn với protein ArsR và tách chúng khỏi mối liên kết với vùng điều khiển,
operon ars thoát khỏi trạng thái bị kìm hãm và chuyển sang trạng thái hoạt động để
chống lại sự có mặt của các kim loại độc kể trên. Gen arsA mã cho ATPase, nó có
nhiệm vụ điều khiển bơm protein thông qua sự thuỷ phân ATP và cung cấp năng
lượng. Gen arsB mã cho protein vận chuyển màng ArsB, tạo nên các kênh vận
chuyển As và Sb ra khỏi tế bào. Hai gen này làm thành phức hệ vận chuyển asen
theo kiểu tiêu hao năng lượng hoặc thẩm thấu hoá học. Gen arsC mã cho asenat
reductase, xúc tác quá trình khử asenat thành asenit. Gen arsD mã cho protein điều
khiển sự hoạt động quá mức của cả operon ars. Với chủng vi khuẩn Staphylococcus
aureus, trên plasmit pI258 cũng tồn tại các gen arsR, arsB và arsC có cấu trúc và
chức năng tương tự như các gen cùng tên ở E. coli. [46, 76]. Theo nghiên cứu của
tác giả Carlin, trên nhiễm sắc thể của E. coli cũng có operon ars nhưng khả năng
kháng asen của các gen này yếu hơn so với các gen ars nằm trên plasmit [16].
1.2.2.2. Các gen chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng trong biosensor vi khuẩn
Gen chỉ thị là gen mã cho các protein chỉ thị. Tự thân các protein này, hoặc
khi đóng vai trò là enzym xúc tác, tạo ra những sản phẩm có thể nhận dạng dễ dàng,
Cơ chất o-nitrophenyl -galactopyranoside (ONPG) dùng với máy so
màu, cách này khá đơn giản, nhanh chóng nhưng độ nhạy kém và
khoảng động học hẹp
Cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -galactoside (X-gal) dùng với
kỹ thuật hoá màu, có thể nhận dạng bằng mắt thường. Cách này về
nguyên tắc cũng giống như cách so màu nhưng thời gian thí nghiệm
dài hơn.
Cơ chất 4-methylumbellieryl--galactopyranoside (MUG) dùng với
máy đo huỳnh quang, cách này có ưu điểm là độ nhạy rất tốt nhưng
cần dùng máy quang phổ huỳnh quang. 28
Cơ chất p-aminophenyl--galactopyranoside (PAPG) dùng với máy
đo điện hoá, cách này cũng có khả năng đo nhanh, nhưng lại cần cho
thêm cơ chất khác phục vụ cho việc đo điện hoá.
Các gen luxAB, luxFF mã cho các luciferase, đó là tên gọi chung cho các
loại enzym xúc tác cho phản ứng phát quang. Quá trình phát ra ánh sáng bởi các cơ
thể sinh vật chứa luciferase được gọi là sự phát quang sinh học. Luciferase có mặt
khá phổ biến trong tự nhiên, có thể tìm thấy ở vi khuẩn, trùng roi, nấm, sứa, côn
trùng, cá, tôm, mực, v.v… trong đó ở vi khuẩn đã tìm thấy nhiều loài chứa
luciferase, ví dụ Vibrio, Photobacterium, Xenorhabdus. Một trong những ứng dụng
sớm nhất của luciferase vi khuẩn là thí nghiệm Microtox. Người ta đưa vi khuẩn
phát sáng tự nhiên vào môi trường có chứa chất độc nào đó. Dựa vào sự suy giảm
của độ phát sáng ở vi khuẩn khi tiếp xúc với chất độc so với đối chứng để suy đoán
mức độc hại của môi trường.
Gen luxAB ở vi khuẩn mã cho luciferase xúc tác cho quá trình ôxy hoá một
flavin khử (FMNH
2
học cao, thí nghiệm đơn giản. Nhược điểm của GFP là có thể bị nhiễu bởi các phân
tử phát huỳnh quang khác vốn có trong tế bào. GFP có độc tính đối với một số dòng
Copyright: Tài liệu đại học ©