I HC QUI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thị Duyên
PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ
GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 MỚI XUẤT HIỆN
NĂM 2011 TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 MỚI XUẤT HIỆN
NĂM 2011 TẠI VIỆT NAM
t hc
: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NG DN KHOA HC: PGS.TS. LÊ THANH HÒA i - 

i

MỤC LỤC
1.2.1. 
5

1.2    m c       t
ch
6

1.2.3. Dch t h 
8
1.3.
ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA VIRUS
CÚM A/H5N1
12

1.3.1. u to c
12

m sinh h h 
13

1.3.3. Hing ct   v
17
1.4.
CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CÁC PROTEIN NP, M VÀ NS CỦA
VIRUS CÚM A/H5N1

21

1.4.1. Protein NP
21

Phƣơng pháp nghiên cứu
27

2.2.1. t RNA tng s (genomic RNA)
28

2.2.2. Thc hin phn ng RT-PCR
30

2.2.3. 
31

2.2.4. Gi
32

2 2.5. i chi  liu
33

2.2.6. X  liu b-sinh hc
33

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
34
3.1.
Thu nhn, ging
Dk-VN--VN-QT1603
34

3.1.1. ng s c hin phn ng RT-PCR
34


TÀI LIỆU THAM KHẢO
69 PHỤ LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA
Ký hiệu
Tiếng Anh
Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa
tiếng Việt
Aa
Amino acid
Axit amin
Bp
Base pair
C
Ck
Chicken

Da
Dalton
      
protein
Dk
Duck

Ngan
MEGA
Molecular Evolutionary Genetics
Analysis

gen
NA
Neuraminidase
i sialic
NT
Nucleotide
Nucleotit
NEP
Nuclear Export Protein
Protein vn chuyn
NP
Nucleoprotein

NS
Non structural protein

PA
Polymerase acidic protein

PCR
Polymerase Chain Reaction
Phn ng PCR

iv



v

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
Tên bảng
Trang
1.1
Th     m ti Vit Nam t  -
2

4
2.1
i s dng trong thu nh 

29
2.2
n phn ng RT-
30
2.3
n phn ng n
31
3.1
  a Vit Nam 

50
3.6
T l ng nht v 
ng v amino acid    a gen M1 gi 
cha Vi th gii 53
3.7
T l ng nht v 
ng v amino aci    a gen M2 gi 
cha Vi th gii 54

vi

3.8
  a Vi
gic s dng gen NS n gen
i quan h ngun gc ph h 57
3.9.
V a gen NS1 chng Dk-
VN-  ng Dk-VN-QT1603 so vi 20 chng virus



vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
1.1
 c t 
6
1.2
 m ca virus  t  
7
1.3
 c lc cao ti Vit
Nam t 2001  2007
11
1.4
nh chu ph
12
1.5
 
13
1.6
 hing ct  n 7
(gen M)   
18
1.7
 p phn polymerase cn
ng chuyi cc v i ct - t 



2.1TOPO (Invitrogen) 
31
3.1
Kt qu n di kim tra RNA tng s ca chng Dk-VN-QT-
ng Dk-

34
3.2
Kt qu n di kim tra sn phm RT-
 hp 

35

viii

3.3
n gia gen
NP chng Dk-VN-

36
3.4
Kt qu n di kim tra sn phm RT-
 hp 

37
3.5
n gia gen M
chng Dk-VN-
1
MỞ ĐẦU
        h Orthomyxoviridae, b
Mononegaviralest ch yu  qun th
p ph bi
A/H5N1  gia cm t  n nay.
Di t 
n bin phc tp ti nhiu quc gia. Vi 
ngi nhi  gii, c
nh i xy ra di 
ngi cn c bing ch.
H gen ca h A,
ga virus.
nh, v bii
   n gen    t bin ho      
ch, d 
ng vt ch mi ca virus. nh c
th c l gii hn  chtm ct protease ca protein
heagglutinin (HA) enzyme ca protein neurominidase (NA)
kh  hp to virus mi, vi c l.
   t bi           
chng virus m so vi chu, s xut
hit bin gen NP, c chng virus
 c l nh ca
chng virus mi. n 5 (gen NP) ng hp nucleoprotein
NP chm vn chuyn RNA gi  , cha

a mt s chp t bnh phm 
gia cm  Vit Nam nm 2011.
2-  bin i  nucleotid cn gen NP,
t amino acid suy din cp vi mt s
ch ca Vi gi.
3- i quan h ph h ci
 gii d n gen NP, M, NS.
 c thc hin tn dch hc - Vi sinh hc.
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
1.1.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
  m  Qu
Quc). M) dm A/H5N1 xut hin  H
i t vong trong tng s nh nhi
v dn trc tii [75].
m  9 qu
t Nam.
n nay, dch bng 
nhi gii [36]. Nhn d
tru gia c t hi nng n v kinh t.
c bi i, v
i nhi  dm xy ra  c gia
 gii [77], [80]. V c lc cao nht
n nay [2], [70].  vng chng sinh hc cho thy chng
  m t gia

Năm
Số
tỉnh
Số huyện
có dịch
Số xã, phƣờng
có dịch
Số gia cầm mắc
bệnh (con)
Số gia cầm chết,
tiêu huỷ (con)
2007
33
115
283
69.207
314.268
2008
27
54
80
13.007
106.058
2009
17
35
71
68.463
105.601
2010

1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
1.2.1. Phân loại và danh pháp virus cúm A/H5N1
- Vị trí phân loại của virus cúm A/H5N1
        h Orthomyxoviridae, b
Mononegavirales [6], virus t ch yu 
qun th p ph bi gia
cm t n nay [21].
(subtype), 
t bi s  
mt ca  [50], [73]. u H1  H16) 
type NA u N1  N9) n, v t s t hp gi
 t[75], [77].
- Kí hiệu và danh pháp virus cúm A/H5N1


 u theo ki
(serotype)  , vit tye virus
/H5N1 thu



 , ki






H5 1, vit t [6], [49].



 2005, 



 /05 



:
A/Duck/Vietnam/AG/05/H5N1. i v  ch     p
c  i b nhim, 

ng vt b nhi
d: A/Vietnam/1194/04/H5N1 [77]. Hình 1.1.  c t 
(A: p  ng vt; B: i).

1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ
t bu
ca virus xy ra ch yu   
th nhim [49], [54].

Hình 1.2.   t  [49].

c gi m, h gen ca virus
s dng b c ca t ng hrotein cn
chuyn ph thuc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phc hp protein 
RNA cc vn chuy [11].
  gen ca virus tng h
a h gen virus, t ng h
gen ca virus mi nh RNA-       
(g- polyA)  - -t hp vi nucleoprotein
(NP) tc hp ribonucleoprotec vn chuyn
8
 ng th h
thng enzyme  tn gen cc enzyme PB2 g-
12 nucleotid Adenin  -c vn chuyn ra bi
i n tng ha virus.
 a virus sau khi tng hc vn chuyn g
m m nh b y ch
(budding) ca virus. NP sau khi tng hc vn chuyn tr l  kt
hp vi RNA tc hp nht
vy chn ch  bi

Sau mnh ti H m b t,
y gc Qum c 
bn mc t chn
tip tc tn ti trong ngng  c, tr  hp
chng mi [14], [76]. - 2002, nhiu chng virus
c
h tclade c lc cao vi vi v ri b
i trong nh 2002 [41]. Tip t- 2003, gen
   t bin mi do hu qu ca hi ng l  
(antigenic drift;  ri to chng nh cc k c bii vi
v i [67].  i
c li vt ch bao gm
v  ru
chng [26],
[57].
 n 1997 - n m
n v t ch, tr 
bnh ri vi gia c 2005 [41], [66]. Tuy
 di truyn hn 1997 -
2002 v   ng nh    i ch  
A/Gs/ n dt x-
2005 [20]. S xut hin ca genotype Z vt trong nh
10
 ng chng ca s t bi
c[41], [81].
Cuc
     xut hi    i (Qinghai and Qinghai-like

-t hin  p lu ti Lng
 ) [19], [53].


phn ln 
m     i enzym galactose, mannose, ribose, fructose,
glucosamin.
Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1: H1 u tn,
bao gm: v RNA s).
Hình 1.4. nh chu ph [2].
(A: nh chu phn t truyn qua. B
cu to h Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân
13
tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: hệ gen
virus).
V n chu to b
n gc t  c hiu h
protein c m mng gai m
- - 6 nm, bao g
m (MA  matrix).
Vt cht di truyn h 
u ss(-)RNA (negative single stranded RNA) [49].
1.3.2. Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1



  RNP, m  n RNP kt hp vi phc hp
polymerase (PB1, PB2, PA) cha virus
trong t 












: PB2; PB1; PA; HA (H5); NP; NA (N1); 

 


- - ca mi ph

  



 o tn
- -UCG(U/C)UUUCGUCC.
 ng 84.10
3
c
t 
3
Da) [49].
  t ch c ch n
v  627  protein PB2 ( ia cm v - ng nhit
  gia cm khong 40
o
 - ng
nhi  i khong 37
o
C) [74].
- Phân đoạn 2 c 2431 bp, cha khung gen PB1
bo t ng hp enzym PB1 - ti a phc
hng hp RNA virus, chm gn
[49].
Gt protein (PB1-F2) chi mt
c m c 273 bp ca PB1 [72]. Protein PB1-
nhy cm vi TNF ( - t theo
a t 

u bing min
dch ca vt ch vi virus, 

 c lc


m trng c

1704 - ng hp protein HA(H5) cha 567 - 568 aa - mt
 m

 ng min dch
 vt ch [29], [54].
       khong 63.10
3
Da (n  c

3
Da (n
1
 48.10
3

HA
2

3
Da) [37], [45].
Protein HA -  mm hai tiu ph
1

HA
2
i gia HA
1

2
gm mt s aa i