SẮC KÝ CỘT
I. NGUYÊN TẮC
II. KỸ THUẬT TRIỂN KHAI
III. RỬA CỘT
IV. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
NGUYÊN TẮC
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong
một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha
tĩnh.
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi
là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng
vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ
và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần
lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel,
CaCO
3
, than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn
hóa.
Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ
thích hợp.
Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng
dần.
Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có
nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán
sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ.
Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có
đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.
NGUYÊN TẮC
KỸ THUẬT TRIỂN KHAI

•
Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
•
Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi
mới.
•
Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu chất
thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là
chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo.





RỬA CỘT
Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có
thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào
trọng lực.
Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí
nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột.
Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào
việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để
giải ly dung môi ra khỏi cột.
Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy
thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.

Ở sắc ký cột cổ điển, thường dùng dung môi tinh khiết có độ phân
cực tăng dần để rửa cột.

CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN
1
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 15:12:2
2
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 8:4:1
3
BuOH/AcOH/H
2
O 4:1:5
4
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 13:7:2
5
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 7:3:1
6

O 4:1:2
14
EtOAc/AcOH/H
2
O 100:16:13
15
Benz/Acetone/AcOH 75:25:1
CHẤT HẤP PHỤ ĐẢO
1
MeOH/H
2
O 1:2
2
MeOH/H
2
O 1:1
3
MeOH/H
2
O 2:1
4
CH
3
CN/MeOH/H
2
O 1:1:1
5
H
2
O/ CH

tinh ngắn với các đường kính thích hợp từ 10-50mm tùy thuộc vào
lượng mẫu phân tích. Dưới đáy cột có gắn một vòi có khóa để dẫn
dung dịch ra ngoài.
Bộ phận điều chỉnh áp suất và tốc độ dòng chảy gồm bộ phận dẫn
khí nén có lắp một van điều chỉnh tốc độ chảy.
Đường kính
cột (mm)
Thể tích
dung môi
rửa (ml)
Lượng mẫu cho vào (mg) Phân đoạn
(ml)
4R
f
≥0,2 4R
f
≥0,1
10 100 100 40 5
20 200 400 160 10
30 400 900 360 20
40 600 1600 600 30
50 1000 2500 1000 50
Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung môi
Chất nhồi cột:
Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 40-
60mm (230-400 mesh)
Dung môi rửa cột:
Dung môi nên có độ nhớt thấp như: CHCl
3
, EtOAc, MeOH.

Ether ethyl
-Hexan
Capsaicinoid Onion RP-18
RP-18 40
mm
MeOH
MeOH-H
2
O
Alcaloid
quinolizidin
Lipinus argentens
Fabaceae
Al
2
O
3
baz
(Merck)
Ether Ethyl
Ether ethyl-
MeOH
Nhồi cột:
Đầu tiên cho một lớp bông thủy tinh lót dưới đáy cột, sau đó cho một lớp
cát biển. Cho từ từ silicagel khô 40-63 mm vào cột, sau đó cho một lớp cát
biển lên trên bề mặt lớp silicagel.
Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp cát biển đến đầy cột, gắn bộ
phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột. Van kim luôn được mở, mở nhẹ
nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió. Áp suất trong cột sẽ gia tăng,
nén lớp dung môi chảy qua cột nhanh. Áp suất được duy trì như vậy đến khi