CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp
bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong 1
ống hình trụ được gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm cột mà
quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân
bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Ở đây chỉ trình bày sắc ký cột
hấp phụ.
I. NGUYÊN TẮC
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất
hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp
phụ.
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa
tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO
3
, than hoạt
tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa.
- Oxid nhôm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh)
o Độ hoạt hóa số I 0,5 % H
2
O
II 2,4 % H
2
O
III 4,3% H
2
O
IV 6,6% H
2
O

chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích thước
tương ứng với chiều dài và kích thước cột:
Đường kính (cm) Chiều dài (cm)
1 15
2 25
3 40
4 60
II. KỸ THUẬT NHỒI CỘT VÀ TRIỂN KHAI SẮC KÝ
II.1 Chuẩn bị cột
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).
- Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi
điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất.
Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột.
Trọng lượng chất phân tích
Tỷ lệ =
Trọng lượng chất hấp phụ
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường từ
1/20, 1/30, 1/50, 1/100,…
Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel,
Sephadex … thì phải ngâm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho vào cột để
tránh làm nứt cột. Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót
vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ
không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót
nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình
hứng, và không được để khô dung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào
cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn
tòan ổn định. Mặt thoáng trên cột phải phẳng, người ta có thể cho thêm một lớp cát hoặc

thử ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung
dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho dung
môi ngấm hết vào cột. Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hành quá trình giải ly.
class="bi x1 y64 w3 h8"
Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ:
Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung
môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột.
Trong 3 cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng
phải đảm bảo các yếu tố sau:
- Chất thử hoà tan hòan tòan.
- Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
- Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi mới.
- Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu chất thử ngấm vào cột
tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo.
III. RỬA CỘT
Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly
cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
- Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột áp
suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích
thước hạt lớn.
- Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không
khí) vào đầu cột. Tốc độ dồng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều
chỉnh. Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng, và có khóa hoặc
dây buộc chặt vào miệng cột
Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích
thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.
Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân
cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực

Bảng 7: Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chất phân cực (dùng
cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng)
CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN
A CHCl
3
/MeOH /H
2
O 15:12:2
B CHCl
3
/MeOH /H
2
O 8:4:1
C BuOH/AcOH/H
2
O 4:1:5
D CHCl
3
/MeOH /H
2
O 13:7:2
E CHCl
3
/MeOH /H
2
O 7:3:1
F CHCl
3
/MeOH/EtOAc/ H
2

O 1:1
C MeOH/H
2
O 2:1
D CH
3
CN/MeOH/H
2
O 1:1:1
E H
2
O/ CH
3
CN/AcOH 7:2:1
Theo dõi quá trình giải ly cột:
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo
dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc
hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng.
Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn
chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất. Khi
chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn
hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh
nghiệm của người thực hành.
IV. SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography)
Xuất phát từ yêu cầu thực tế là cần phải có một phương pháp tách và tinh chế các hợp
chất thiên nhiên với một lượng mẫu nhỏ, thời gian tiến hành nhanh chóng và làm giảm
bớt khả năng phân hủy của các chất có thể gặp trong trường hợp sắc ký cổ điển.
Phương pháp sắc ký nhanh đã được nghiên cứu và công bố đầu tiên bởi W. CLARK
STILL , MICHEAL KAHN, ABHIJIT MITRA vào năm 1978 và được đăng ký bằng phát

30 400 900 360 20
40 600 1600 600 30
50 1000 2500 1000 50
Chất nhồi cột:
Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 40-60µm (230-400
mesh)
Bảng 9: Các loại silicagel dùng trong FC
Nhãn hiệu Loại silicagel Cỡ hạt
(µm)
Diện tích bề
mặt (cm
2
/g)
Amicon (Danvers, MA) Si 60
Si 100
20-30
50-105
500 (60 Ǻ)
300 (100 Ǻ)
J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40-63
63-200
100-425
480
EM.Science / Merck
Gibbstonin, NJ
Si 40
Si 60
Si 100
25-40
63-200

3
, EtOAc, MeOH.
Dùng SKLM để tiến hành thử hợp chất cần sắc ký để tìm hệ dung môi thích hợp sao
cho các thành phần trong hỗn hợp có giá trị R
f
≥ 0,35. Như vậy nếu trong hỗn hợp
gồm nhiều chất thì chất phân cực nhất phải có giá trị R
f
tối thiểu là 0,35.
Việc tách đạt hiệu quả tốt nếu sự khác biệt về hằng số R
f
của các chất trong hỗn
hợp đạt điều kiện R
f
>0,15. Tuy nhiê,n trong một số trường hợp nếu ∆R
f
không đạt
yêu cầu trên thì có thể dùng giải pháp tăng chiều dài cột và giảm lượng mẫu phân tích
và điều chỉnh hệ dung môi. Bằng những biện pháp trên, Still và cộng sự đã tách ra
được những chất có ∆R
f
>0,1 và ∆R
f
>0,05.
Hệ dung môi dùng cho pha thường là các dung môi có độ phân cực thấp như ether
dầu hỏa, hexan, ethyl acetat.
Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường là các dung môi có độ phân cực cao như
MeOH, H
2
O, MeOH-H

(Merck)
Ether Ethyl
Ether ethyl-
MeOH
Nhồi cột:
Đầu tiên cho một lớp bông thủy tinh lót dưới đáy cột, sau đó cho một lớp cát biển.
Cho từ từ silicagel khô 40-63 µm vào cột, sau đó cho một lớp cát biển lên trên bề mặt
lớp silicagel.
Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp các biển đến đầy cột, gắn bộ phận điều
chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột. Van kim luôn được mở, mở nhẹ nhàng cho dòng khí
chảy qua, tay bịt air gió. Áp suất trong cột sẽ gia tăng, nén lớp dung môi chảy qua cột
nhanh. Áp suất được duy trì như vậy đến khi tất cả không khí trong cột bị đuổi ra
ngòai. Chú ý không được để lớp Silicagel trên đỉnh cột bị khô.
Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất cần sắc
ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất cả dung dịch
mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế để rửa quanh thành cột.
Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt đầu hứng các phân đoạn. Lượng
dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng.
V. SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography)
Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp suất kém để gia
tăng tốc độ giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với FC là cột sắc ký được rút khô sau
mỗi phân đoạn thu được.
Dụng cụ gồm phễu lọc xốp bằng thủy tinh. Phễu này có bán sẵn trên thị trường với đủ
loại kích thước thích hợp. Một hệ thống tạo áp thường dùng vòi nước hơn là máy bơm vì
chỉ cần áp suất vừa phải.
Chất hấp phụ thường dùng là silicagel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40-15
µm) hoặc Al
2
O
3