Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 3
Giới thiệu chung
1.Rifamycin:
Là nhóm chất kháng sinh trao đổi bậc hai, được thu nhận tự nhiên từ quá trình lên men vi
khuẩn Amycolatopsis mediterranei, hoặc được tổng hợp. Nó là phân lớp của họ Ansamycin.
Rifamycin đặc biệt có hiệu quả chống lại mycobacteria, nó được sử dụng để chữa trị bệnh lao,
phong và các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh phong và lao gây ra.
Rifamycin được dùng để tổng hợp nên những loại thuốc đặc hiệu cao, gồm các dẫn xuất
Rifampicin (Rifampin), Rifabutin và Rifapentine.
Rifamycins được phân lập lần đầu tiên năm 1957 từ quá trình lên men Streptomyces
mediterranei ở phòng thí nghiệm Gruppo Lepetit SpA, Milan bởi Piero Sensi và Pinhas
Margalith. Có tất cả 7 loại Rifamycins được tìm ra: Rifamycin A, B, C, D, E, S và SV. Trong đó,
Rifamycin B được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Lepetit nhận bằng sáng chế cho Rifamycin B ở
Anh vào 8/1958, ở Mỹ vào 3/1959. Thuốc được sử dụng để chống lao từ 1960.

Hình 1. Công thức cấu tạo của Rifamycin B và Rifamycin SV
Vi khuẩn kháng rifampicin là do có sự thay đổi cấu trúc ở tiểu đơn vị beta của enzym ARN-
polymerase. Tuy vậy, kháng thuốc của các vi khuẩn lao với rifampicin thường thấp hơn các vi
khuẩn khác. Nên rifampicin được giành riêng cho điều trị nhiễm khuẩn lao và các nhiễm khuẩn
nặng do vi khuẩn nhạy cảm đã kháng nhiều thuốc.
2. Sơ đồ tổng hợp Rifamycin B:
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 4

6
nhà vi sinh vật học làm việc với công ty dược phẩm của Ý Group Lepetit SpA tại Milan, Grazia
Beretta và Pinhas Margalith.
Năm 1969 vi khuẩn này đã được đổi tên thành Nocardia mediterranei khi một nhà khoa học
có tên Thiemann phát hiện thấy rằng nó có thành tế bào điển hình của các loài Nocardia. Sau đó,
vào năm 1986 nó đã được đổi tên lần nữa thành Amycolatopsis mediterranei, như là loài đầu tiên
của một giống mới, bởi vì một nhà khoa học có tên Lechevalier khám phá ra rằng thành tế bào
của nó thiếu mycolic acid và nó không có khả năng bị tấn công bởi các thể thực khuẩn ăn
Nocardia và Rhodococcus.
b) Phân lập giống Streptomyces mediterranei:
- Bào tử của Streptomyces mediterranei được xử lý với N-methyl-N'-nitroso-N-itroguanidine
nồng độ 1 mg/ml với pH 9.0, trong 60ph ở 28°C. Bào tử đã được gây đột biến rửa, đổ lên hộp
petri chứa môi trường agar Bennett. Sau 14 ngày nuôi cấy ở 28°C, khuẩn lạc nào còn sống sót sẽ
được lựa chọn sản xuất Rifamycin B trên môi trường lỏng. Streptomyces mediterranei bị đột
biến được gọi là M 18 ATCC 21789 2290 2240.
- Một hệ thống nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất Rifamycin B được ứng dụng dựa
trên giống S. mediterranei, trong quá trình sinh trưởng trên môi trường agar Bennett nó sẽ tạo
thành 6 dạng khuẩn lạc có hình thái khác nhau. Có sự tương quan rõ ràng giữa hình thái của
khuẩn lạc và khả năng sản xuất Rifamycin B. Hiệu suất sản xuất Rifamycin cao nhất đạt được
khi sử dụng khuẩn lạc có màu đỏ cam, hình hoa hồng trống ở giữa và đường kính dài 2-3mm.
Tuy nhiên do tính chất thay đổi của những dạng thù hình còn có những cụm vi khuẩn có hình
thái khác cũng thích hợp được lựa chọn để làm giống cho nghiên cứu.

KH
2
PO
4
(E.Merck, Darmstadt, Germany)
CoCl
2
(E.Merck, Darmstadt, Germany)
Chất chiết nấm men
Cao thịt
Tinh chất malt
Agar
Tinh bột
Peptone
Bột đậu nành
Bột yến mạch
Bột cá
Nước cất
b) Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5% bột cá, 0,8 %
KNO
3
, 0,05% KH
2
PO
4
, 0,0001% CoCl
2
, 0,5 % CaCO
3
.
III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ:
1. Nhân giống:
 Mục đích: gia tăng sinh khối vi sinh vật
 Quá trình gồm 2 giai đoạn:
 Cấy giống trên thạch nghiêng:
- Tỉ lệ thành phần cho 1l môi trường: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất mạch nha, 4g
glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất cho đủ 1l.
- Thời gian ủ: 7-8 ngày
- Nhiệt độ: 28
o
C
Tẩy màu
Kết tinh
Chưng cất
Trích ly
Lên men
Nhân giống
Nocardia mediterranei


o
C
- Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10% (v/v)
=> Để lên men 30m
3
môi trường cần có 120 erlen. Khi nhân giống cho các mẻ lên men
tiếp theo ta có thể lấy 2ml canh trường của các erlen này cho vào erlen mới có thành
phần giống như erlen đã lên men, bỏ qua giai đoạn cấy giống trên thạch nghiêng.

Hình 7. Rotary Shaker
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 10
2. Tiệt trùng:
 Mục đích: chuẩn bị môi trường vô khuẩn cho lên men.
 Thiết bị tiệt trùng: YHC-20
- Nhiệt độ tiệt trùng: 130
o
C
- Thời gian môi trường lưu ở nhiệt độ tiệt trùng: 6 phút
- Năng suất tiệt trùng: 20m
3
/h
- Lượng nước ngưng: 0,5m
3
/h
 Nguyên tắc hoạt động:


-
6000
1,7m
3
.
35 p 50mm.
100m
2
.
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 12
i
YHC- 77%.
-
.
3. Lên men:
 Mục đích: Streptomyces mediterranei tổng hợp rifamycin B từ môi trường lên men.
 Điều kiện lên men:
- Lên men hiếu khí. Lượng oxy cung cấp chiếm 25% thể tích môi trường lên men.
- - - - -
- o; 18- - ả
600-1000 150-200
ục 2000-
.
– 8, 12, 14.
110- .
6-
c 120-1 60m
2
45m
2
600 n
2,4m.
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 14
0,25MP
130-140
o
50
n 1m
3
/ (m
3
5-6
n 8m.
0,28Mp

theo Rifamycin B lại được trích ly ngược sang dung dịch đệm phosphate, pH 7.38. Sau đó
Rifamycin B lại được trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi ít hơn.

Hình 13. Sơ đồ trích ly Rifamycin B
 Thiết bị: Robatel BXP 520 (France)
- Lưu lượng tối đa của dòng lưu chất qua thiết bị: 1500 l/min
- Khối lượng tối đa của dòng lưu chất qua thiết bị: 140 kg
- Nhiệt độ cho phép: 5-85
o
C. Chọn nhiệt độ trích ly là 10
o
C

Hình 14. Máy trích ly Robatel BXP 520
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 16
5. Chưng cất:
 Mục đích: cô đặc dung dịch sau trích ly, thu hồi dung môi.
 Nguyên tắc: dung môi ethyl acetate bay hơi ở nhiệt độ 77,2
o
C, còn Rifamycin B không
bay hơi.
 Phương pháp:
- Chưng cất có hồi lưu sản phẩm đỉnh, cấp nhiệt gián tiếp bằng hơi nước.
- Sử dụng tháp chưng cất nhiều mâm.
- Nhập liệu ở giữa tháp.
- Thu sản phẩm đáy có nồng độ Rifamycin B ≥ 70%

Các thông số công nghệ của quá trình kết tinh là :
- Nồng độ Rifamycin B trong dung môi: ≥ 70 %
- Nồng độ muối acetat: 0,1%
- Nhiệt độ kết tinh 28
o
C
 Thiết bị kết tinh:
Giống thiết bị cô đặc chân không, nhưng vì dung dịch đặc, đối lưu khó nên thiết bị truyền nhiệt
có chiều cao thấp hơn và đường kính rộng hơn. Các thiết bị làm lạnh yêu cầu bề mặt tiếp xúc lớn,
và có bộ phận khuấy đảo với tốc độ chậm để tránh tinh thể lắng xuống đáy thiết bị và tăng tốc độ
kết tinh. Hệ thống thiết bị phải bao gồm cả hệ thống kiểm tra như: đo nhiệt độ, áp suất, hệ số quá
bão hòa, kích thước và số lượng tinh thể
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 18

Hình 16. Sơ đồ thiết bị kết tinh
Sau khi kết tinh, tinh thể Rifamycin B được lọc tách bằng máy lọc hút thùng quay. Để đảm
bảo độ tinh khiết cao hơn, có thể tiến hành hòa tan và kết tinh lại Rifamycin B.
8. Lọc, sấy thu Rifamycin B tự nhiên:
 Mục đích: đuổi hết dung môi trích ly, giảm hàm ẩm, hoàn thiện sản phẩm.
 Phương pháp:
Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không dưới 99,5%,
chúng được lọc tánh tinh thể; tiếp theo rửa và làm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như
izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi rồi sấy bằng không khí nóng đến
dạng sản phẩm tinh thể Rifamycin B.
 Thiết bị sấy chân không kiểu thùng quay (thích hợp cho dược phẩm)
Báo cáo Công nghệ lên men

2.Các sản phẩm tổng hợp được từ Rifamycin B:
Rifamycin B được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm cần thiết
khác: Rifamycin O, S, SV và Rifampicin.
Dựa vào các phản ứng hóa học đặc trưng để chuyển từ Rifamycin B thu được thành
Rifamycin: O, S, SV, Rifampicin.
- Rifamycin B với sự có mặt của sodium persulphate, bị oxy hóa thành Rifamycin O.
- Rifamycin O bị thủy phân bởi acid sulfuric và tetra-hydzofuan thành Rifamycin S.
- Rifamycin S phản ứng với t-butyl-amine và manganese-di-oxide, sau đó thủy phân bằng
acid ascorbic và acid sulfuric để tạo 3-formyl-rifamycin-SV (3FRSV).
Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 21
- Giai đoạn cuối cùng là cho 3FRSV phản ứng với 1-amino-e-methyl và 1 số dung môi khác
để tạo Rifampicin.
Rifampicin:

Hình 20. Rifampicin BD-05
Là sản phẩm tổng hợp từ Rifamycin B.
Công thức: 3-{[(4-Methyl-1-piperazinyl)imino]-methyl}rifamycin.
Rifampicin có tác dụng tốt với các chủng vi khuẩn Mycobacterium đặc biệt là
Mycobacterium tuberculosis, vi khuẩn phong Mycobacterium laprae và các vi khuẩn cơ hội
M.bovis, M.avium. Nồng độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0.1-2microgam/ml.
Rifampicin còn là kháng sinh phổ rộng có tác dụng tốt với các vi khuẩn gram dương và âm
(trừ cầu khuẩn đường ruột) như lậu cầu, não mô cầu, liên cầu, kể cả chủng kháng methicillin
Haemophilus influenzae.
Cơ chế tác dụng của Rifampicin: thuốc gắn vào tiểu đơn vị beta của ARN-polymerase, làm
sai lệch thông tin của enzym này, do đó ức chế sự khởi đầu để tổng hợp ARN mới.
Trên người ARN-polymerase ít nhạy cảm với thuốc nên ít độc, trừ khi dùng liều rất cao.


Báo cáo Công nghệ lên men
Rifamycin 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Bạch Tuyết, Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo
dục, 360 trang, 1996.
2. Trương Thị Minh Hạnh, Giáo án môn học Công nghệ dược phẩm, Đà Nẵng, 2007.
3. Lê Văn Hoàng, Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nhà xuất bản
Khoa Học Kỹ Thuật, 356 trang, 2004.
4. Nguyễn Lân Dũng, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu,
(
5. W. R. Strohl, Biotechnology of antibiotics, edition 2, published by Information Health Care,
1997
6. Optimization of industrial production of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei, African
Journal of Biotechnology Vol. 3 (5), pp. 266-272, May 2004.
7. Scale-up of rifamycin B fermentation with Amycolatoposis mediterranei, Journal of Zhejiang
University SCIENCE.
8. Robert M. Sterritt, Microbiology for environmental and public health engineers, John N.
Lester publication, London, E and F. N Spon Limited, 1998.
9. H J. Rehm and G. Reed n cooperation with A. Puhler and P. Stadler, Biotechnology second
Completely Revised Edition, Volume 7, 1997.