ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh bột, protein và cellulose là các sản phẩm tự nhiên có vai trò quan
trọng, có nhiều ứng dụng trong sản xuất và trong đời sống con người. Trong chế
biến tinh bột, cellulose, protein, mục đích của các nhà máy hay các cơ sở sản
xuất chế biến là chuyển hóa chúng từ các hợp chất có phân tử lượng cao hệ số
hấp thu kém, giá trị thương phẩm thấp thành các sản phẩm mới có hệ số hấp thu
cao hơn, có giá trị thương phẩm cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi vào nhiều
ngành công nghiệp chế biến liên quan khác. Công đoạn quan trọng nhất để đạt
được mục đích này là thuỷ phõn chỳng thành những hợp chất đơn giản, đó là các
đường đơn, các axit amin. Tinh bột, cellulose, protein được thủy phân là nhờ vào
ba nhóm enzyme chủ yếu là amylase, cellulase và protease, tuy nhiên trên thực tế
việc tách chiết các enzyme này từ những nguồn nguyên liệu tương ứng là rất khó
khăn và hiệu xuất thu được là không cao, vi dụ như amylase được tách chiết từ
mầm của các loại ngũ cốc, cellulase được tách chiết từ dịch chiết dạ dày bò hay
trong hạt ngũ cốc nảy mầm, còn protease cũng được tách chiết từ thực vật hay
động vật (đu đủ, dạ dày bờ,…) [2].
Chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu thực vật và động vật không thể
dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô công nghiệp bởi một số
nhược điểm như; chu kỳ sinh trưởng của chúng dài, hai nguồn nguyên liệu này
khó cải tạo. Trong khi đó cả ba loại enzyme trên đều được sản sinh bởi tế bào vi
sinh vật, nguồn enzyme ở vi sinh vật vô cùng phong phú và có ở hầu hết cỏc
nhúm vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, [3].
Có thể nói vi sinh vật là nguồn tài nguyên phong phú, thích hợp nhất để
sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. So với
enzyme được tách chiết từ động vật, thực vật, enzyme được tách chiết từ vi sinh
vật thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo, cũng như khắc phục
được những khó khăn và hạn chế ở trên [3].
Tuy nhiên, các nghiên cứu và ứng dụng mới chỉ tập trung vào đối tượng
chính là nấm men và vi khuẩn Bacillus mà chưa nghiên cứu đến vi khuẩn lactic,
dựa trên những hiểu biết về vi khuẩn lactic thì đây là một nguồn thu enzyme từ
sử dụng trong sản xuất sữa chua [17].
Ngày nay, những hiểu biết về vi khuẩn lactic đó khỏ đầy đủ. Vi khuẩn
lactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến, và nó có khả năng sinh ra các
enzyme, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các chất có khả năng ức chế
hoặc tiêu diệt nhóm vi sinh vật gây bệnh, điều đó giúp cho chúng có khả năng
tồn tại và sinh trưởng tốt trên nhiều loại nguyên liệu khi đem lên men. Loại cơ
chất mà vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa rất phong phú, có thể là protein,
cellulose, glucose hay tinh bột nhờ vào hệ enzyme phong phú. Vì vậy ba hoạt
tính sinh amylase, cellulase, protease của vi khuẩn lactic là một tiêu chuẩn quan
3
trọng để tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn lactic có những đặc tính sinh học
mong muốn sử dụng trong các quá trình lên men. Đây là hướng nghiên cứu rất
có triển vọng để nhằm phát hiện và ứng dụng những nguồn enzyme mới trong tự
nhiên làm tăng hiệu suất lên men trong sản xuất các sản phẩm lên men, từ đó
giúp giảm bớt tác hại của các chất hóa học và giảm giá thành sản phẩm.
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
1.1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen
Orla-Jensen đã phân loại vi khuẩn lactic dựa vào những đặc điểm hình thái
học (cầu khuẩn hoặc trực khuẩn), kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt
độ khác nhau, mức độ sử dụng đường. Ông xếp chúng thành bốn giống:
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [17]. Ngày nay người
ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi.
INCLUDEPICTURE
" \*
4
MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE
" />nmr/streptococcus20pneumoniae.jpg" \* MERGEFORMATINET
Hình 1.1: Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic
• Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả năng phân huỷ đường đơn giản và tạo
nên axit lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình.
C
6
H
12
O
6
→ 2CH
3
CH(OH)COOH + 22,5 Kcalo
Do hệ enzyme trong những vi sinh vật khác nhau thường khác nhau nên
cơ chế hoá học của quá trình lên men lactic ở các giống vi sinh vật thường không
giống nhau.
Ở vi khuẩn lactic đồng hình sự chuyển hoá đường thành axit lactic đi theo
con đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, axit này được khử hai
nguyên tử hidro nhờ hoạt động của lacticodehydrogenase để trở thành axit lactic.
6
CH
3
COCOOH + 2H CH
3
CHOHCOOH
• Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, gọi là lên
men lactic dị hình, chúng tạo nên trong môi trường ngoài axit lactic còn có nhiều
sản phẩm phụ: axit axetic, rượu etylic, CO
2
, H
2
và dị hình. Vì quá trình lên men dị hình ngoài việc tạo thành axit lactic còn tạo
các sản phẩm phụ như axit và rượu sinh ra este có mùi thơm làm cho sản phẩm
có hương vị đặc trưng [14].
1.1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Trong sinh giới có khoảng 400 – 500 chi vi khuẩn được biết đến, trong đó
đó cú 13 chi được biết đến là vi khuẩn lactic (xem bảng 1.1).
Bảng 1.1: Các chi và số loài của vi khuẩn lactic được biết đến.
Chi Loài Chi Loài
1. Lactobacillus 75 8. Lactococcus 8
7
2. Carnobacterium 6 9. Vagococcus 2
3. Lactosphaera 1 10. Leuconostos 10
4. Atopobium 3 11. Onenococcus 1
5. Weissella 7 12. Pediococcus 7
6. Streptococus 50 13. Tetragenococcus 2
7. Enterococcus 19
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến trong tự nhiên,
loại cơ chất mà vi khuẩn lactic tham gia chuyển hoá rất phong phú từ tinh bột,
cellulose, protein, vì vậy vi khuẩn lactic đã được phân lập từ rất nhiều nguồn
mẫu khác nhau từ thịt chua, cỏ ủ chua,
Nhìn chung vi khuẩn lactic cú cỏc đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa
như sau:
- Thuộc vi khuẩn Gram dương.
- Không sinh bào tử, không có khả năng di động.
- Hình dạng tế bào có thể là hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,
Leuconostos, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus). Người ta phân
biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình.
- Phản ứng âm tính với catalase (đây là dấu hiệu của vi khuẩn kỵ khí).
- Có khả năng lên men đường để tạo axit lactic.
lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm
nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO
2
.
Các loại vi khuẩn khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi
khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột. Sự phát triển của vi khuẩn
9
lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và
sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những
áp lực của các quá trình xử lý sau này [15, 16].
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần
lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có
chứa nitơ nờn chỳng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Để sinh trưởng
và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn
lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân
protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch
chiết thịt, trypton…Đõy cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để
chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên
cứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà
nâng cao được hiệu quả sản xuất. Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sử
dụng khá nhiều [15, 16].
Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng
Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với
Lactobacillus, Mn
2+
, Mg
2+
và phát triển của vi khuẩn. Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa
ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ 37
0
C [16].
1.1.2. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
trong các ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp sản
xuất axit lactic, công nghiệp chế biến, bảo quản rau quả và trong chế biến thức
ăn gia súc.
11
Trong công nghiệp chế biến sữa, vi khuẩn lactic đóng vai trò quyết định và
tạo hương vị cho sản phẩm. Chúng được sử dụng để chế biến nhiều loại sữa
chua, phomat,… Các chủng vi khuẩn lên men lactic để sản xuất sữa chua như
Streptococcus, S. cremoris, và một số loại sinh hương. Sữa được làm chín tạo
thành phomat nhờ một số chủng vi khuẩn như: Streptococcus, S. cremoris,
Lactococcus casei, L. helventicum. Để sản xuất bơ, nguyên liệu váng sữa được
cấy là Streptococcus lactic, S. cremoris, Leuconostoc cremoris. Ngoài ra cũn cú
cỏc chủng vi khuẩn khác sinh hương tốt như: Streptococcus citrovorus, S.
parcitrovorus, S. diacetylactic [13].
Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, vi khuẩn lactic có tác dụng làm cho
bột chua và làm nở bột bánh mỳ.
Từ những năm 1894, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng để sản xuất axit
lactic phục vụ cho các ngành công nghiệp thuộc da, vải sợi, dược phẩm.
Ngày nay, hơn một nửa sản phẩm axit lactic trên thế giới được sử dụng
trong công nghiệp thực phẩm, khoảng một phần năm là sử dụng Stearoyl -2-
lactylate trong sản xuất công nghiệp, còn lại sử dụng ở công nghiệp dược và một
số ngành kỹ thuật khác. Axit lactic được bổ sung vào nước chiết quả, nước
chanh, nước cam,… dùng trong công nghiệp đồ hộp, thịt cá, rau quả.
Vi khuẩn lactic còn được sử dụng làm vi khuẩn chỉ định trong nhiều
tinh, … nhưng các phương pháp này cũng ảnh hưởng một phần đến hoạt tính của
enzyme [1].
Enzyme ngoại bào chủ yếu là enzyme thuỷ phân khử những khoáng chất
có trọng lượng phân tử cao vào những khối xây dựng của chúng bằng cách tạo
13
những phân tử ngậm nước. Điều này giúp phóng thích những phân tử nhỏ hơn,
có thể được vận chuyển vào tế bào và tiờu hoỏ [3].
Các enzyme ngoại bào tham gia thuỷ phõn cỏc hợp chất hữu cơ phổ biến,
đó là thuỷ phân tinh bột, thuỷ phân lipid, thuỷ phân casein, thuỷ phân gelatin.
1.2.2. Một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase,protease) của vi khuẩn
lactic
1.2.2.1. Amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến có vai trò chuyển hóa tinh bột đã
hồ hóa, thậm chí cả tinh bột sống. Dựa trên tính chất và cách tác dụng lên tinh
bột mà phân biệt amylase thành α – amylase, β – amylase, glucoamylase, và
oligo 1- 6 glucozitase.
Hình 1.2: Cấu trúc không gian phân tử α – amylase
Amylase phân hủy tinh bột giải phóng ra glucose ở dạng α – amutanmer
nên được gọi là α - amylase. α - amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần
axit amin khác nhau, mỗi loại α - amylase có một tổ hợp axit amin đặc hiệu
riêng. α – amylase là một protein giàu thyrosine, tryptophan, axit glutamic và
aspartic. Nó có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4- glucozit nằm ở phía bên
trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo trật tự. Liên kết α – 1,6 –
14
glucozit không bị thủy phân sẽ kìm tỏa các mối liên kết α – 1,4- glucozit gần nó
làm cho α - amylase không được tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩm
tạo ra là các dextrin chứa cả liên kết α – 1,4 và α – 1,6 – glucozit [ ]. Điều kiện
tối ưu cho sự hoạt động của α – amylase từ các nguồn khác nhau thường không
Trong công nghiệp rượu cồn: Nhiều năm gần đây chế phẩm α – amylase
đã hoàn toàn thay thế malt trong sản xuất rượu, cồn và kết quả đem lại là tiết
kiệm được hàng chục tấn lúa mạch có chất lượng, tăng năng suất rượu, thời gian
sản xuất chế phẩm được rút ngắn, giảm chi phí cho sản xuất và tiết kiệm điện
năng.
Trong công nghiệp bia: Nguyên liệu chính trong quy trình sản xuất bia là
malt đại mạch, trong những trường hợp malt không đảm bảo chất lượng thì hiện
nay ở nhiều nước trên thế giới người ta thay thế 25 – 50% malt bằng các nguyên
liệu thay thế (nguyên liệu phi malt) đó là các hạt chưa nảy mầm như đại mạch
loại hai, loại ba, ngụ…trong trường hợp này người ta phải bổ sung chế phẩm
amylase để có được chất lượng dịch lên men được đảm bảo [8].
Trong sản xuất bánh mỳ: Nếu thêm vào bột nhào 0,002-0,003g chế phẩm
amylase sẽ làm cho hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp của bánh mỳ
tăng lên một cách rõ rệt.
Trong công nghiệp dệt: Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước
khi nhuộm, rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫn
tốt mà còn đảm bảo vệ sinh do đó tăng được năng suất lao động.
16
Trong y học: Dùng α – amylase sản xuất glucose tiêm hoặc bổ trợ cho bữa
ăn của bệnh nhân khi cơ thể bị yếu.
1.2.2.2. Cellulase
Cellulase là một hệ enzyme cảm ứng thuỷ phân cellulose tạo thành sản
phẩm cuối cùng là glucose. Hệ cellulase gồm ít nhất ba loại chính:
- Endoglucanase thuỷ phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong mạch
cellulose tại vùng vô định hình một cách ngẫu nhiên, tạo ra các
oligosaccharide có độ dài khác nhau và các điểm cuối mạch mới [18,
19, 20].
- Exoglucanase thủy phân từ đầu mạch cellulose tạo thành các sản phẩm
chính là cellobiose hoặc glucose. Có hai loại exoglucanase
thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men.
18
Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast),
có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế
bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố và tế bào mẹ.
1.2.2.3. Protease
Protease (peptit – hidrolase 3.4) là tên gọi chung cho nhóm enzyme xúc
tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử
protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin, pepton hoặc di-
tripepton. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phõn liờn kết este
và vận chuyển axit amin [17].
Hình 1.4: Cấu trúc không gian của phân tử Protease
* Các loại protease:
Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng
như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm hai loại
endopeptidase và exopeptidase.
19
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia làm
hai loại:
Aminopeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N
của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, một dipeptid hoặc một
tripeptid.
Cacboxypeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, hoặc một dipeptid.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia ra làm
bốn nhóm:
Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng trong hoạt động xúc
màu dịch thuỷ phân.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm, thời gian chế biến
thường dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc vào rất nhiều địa
phương, phương pháp gài nén nguyên liệu cỏ. Nờn hiện nay quy trình sản xuất
nước mắm đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme vi sinh vật để
rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh
quy, … protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp và nở tốt hơn.
21
Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc.
Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thuỷ
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da
bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.
Trong công nghiệp dệt: Protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ
nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được
bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thuỷ phân lớp protein serisin đã làm dính
bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm
lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác
như: điều chế dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong
thực phẩm, và sản xuất một số thức ăn kiêng.
CHƯƠNG 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh
- Tủ sấy
- Máy lắc ổn nhiệt
- Máy ly tâm Sigma – Mỹ
- Kính hiển vi điện tử Axio
- Kính lúp 3D
- Nồi hấp khử trùng Lequenx – Pháp
- Máy đo pH Accument – Mỹ
- Cân điện tử AL300 – Mỹ
Ngoài ra còn có rất nhiều dụng cụ phục vụ công tác nghiên cứu làm thí
nghiệm khác như hộp lồng (đĩa petri), ống nghiệm, pipet, bình tam giác với đủ
các dung tích khác nhau, đèn cồn, que cấy, que gạt,…
2.3.1.4. Môi trường dùng trong nghiên cứu
Môi trường MRS (g/l) dùng cho giai đoạn phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
lactic.
Thạch - 15,0 g; Glucose - 20,0 g; CaCO
3
- 5,0 g; Cao thịt - 10,0 g; Cao
men - 5,0 g; Pepton - 10,0 g; Tween 80 - 1,0 ml; K
2
HPO
4
- 2,0g; CH
3
COONa
-5,0 g; Triamoniumcitrat - 2,0 g; MgSO
4
.7H
2
O - 0,58g; MnSO
4
O
C/ 15 phút.
Môi trường Casein (g/l) để xác định hoạt tính protease.
Thạch - 17,0 g; Casein không thủy phõn - 1,0 g;H
2
O - 1000,0 ml; pH = 7,
khử trùng ở 121
O
C/ 15 phút.
Chú ý: Với môi trường có chứa cơ chất là casein, phải hòa tan casein
trong dung dịch NaOH 0,1N đến khi casein tan hoàn toàn, sau đó chỉnh pH
môi trường bằng 7.
Môi trường thạch thường (g/l) dùng cho bước kiểm tra hoạt tính kháng
khuẩn của vi khuẩn lactic.
Thạch - 15,0 g; Pepton - 5,0 g; NaCl - 1,0 g; Cao thịt - 2,0 g;H
2
O - 1000,0
ml; pH = 7, khử trùng ở 121
O
C/ 15 phút.
2.3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
2.3.2.1. Phân lập và thuần khiết giống
Phân lập
25
Copyright: Tài liệu đại học ©