Khoá luận tốt nghiệp
LỜI MỞ ĐẦU
Việc nghiên cứu, sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc để chữa
trị các bệnh của con người đang là hướng thu hút sự tập trung của các nhà
khoa học, đặc biệt là các nhà hoá học hữu cơ và các nhà hoá học các hợp chất
thiên nhiên. Nhờ những nghiên cứu này mà một loạt các thuốc có nguồn gốc
từ thảo dược đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược. Điểm thuận lợi
của các hợp chất này là Ýt độc, dễ hoà hợp với người và nguồn cung cấp
chúng thường rất phong phú với việc gây trồng có thể thực hiện được dễ
dàng.
Artemisinin, mét sesquiterpen có trong cây Artemisia annua hay còn
gọi là thanh hao hoa vàng có hoạt tính kháng sốt rét rất mạnh, hợp chất này đã
được các nhà nghiên cứu Trung Quốc phân lập từ những năm 70. Gần đây,
các nhà khoa học Mỹ còn nhận thấy, hợp chất này có khả năng tiêu diệt các tế
bào ung thư vú và bạch cầu. Do vậy, việc phân lập, xác định cấu trúc và
nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét và chống ung thư của hợp chất này góp
phần làm sáng tỏ phần động của hoá học các hợp chất thiên nhiên đó là môi
tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của hợp chất hữu cơ.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ TERPEN.
1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên.
Khái niệm terpen được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên mà
cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren [1]. Theo qui tắc isopren
mà người ta phân biệt ra các monoterpen C
10
, sesquiterpen C
15
, diterpen
C

CH
2
OH
Quinon-methin (Diterpen) Ceroplastol-1 (Sesterterpen)
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
HO

Lanosterol (Triterpen)
Hình 1: Sự đồng nhất về cấu trúc của các terpen.
Bên cạnh thuật ngữ “terpen” ta còn dùng khái niệm “terpenoid” [2] để
bao hàm rộng rãi cả các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon, và các
dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ như các terpen-
ancol, -andehit, -xeton, -axit, -este, -epoxit, v.v Tuy nhiên trong khi sử dụng
thường không có sự phân ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và
“terpenoid” như vừa nêu. Thuật ngữ “terpen” nhiều khi được dùng để bao
hàm cả các terpen-hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng.
Các terpen phân bố rộng rãi trong tự nhiên, xuất hiện trong tất cả các
loài sinh vật nhất là trong giới thực vật bậc cao. Mỗi loài cây riêng biệt
thường có chứa những thành phần terpen đặc trưng vì vậy việc xác định thành
phần các terpen trong cây có thể góp phần vào phân loại thực vật
(Chemotaxonomie). Các mono- và sesquiterpen xuất hiện chủ yếu trong các
tinh dầu; sesqui-, di- và triterpen có trong các dầu nhựa và nhựa; tetraterpen
trong các chất màu thực vật (các carotenoid) và các polyterpen có trong nhựa
mủ cây.
1.1.2. Cấu trúc của terpen
Các terpen được cấu tạo từ các đơn phân là
isopren CH
2
= C – CH = CH

2
OH

CH=O
H
3
C CH
3
CH
3
H

CH=O
H
3
C CH
3
CH
3
Geraniol Neral Citronellal
Trong khoảng ba chục năm trở lại đây người ta tìm thấy trong các cây
thuộc họ Compositae một sè monoterpen có khung cacbon được cấu tạo
không tuân theo qui tắc isopren [4]. Đó là các monoterpen mạch không vòng
thuộc các kiểu khung artemisyl, santolinyl, lavandulyl cùng với một vài
monoterpen đơn vòng thuộc khung chrysanthemyl. Về mặt nguồn gốc sinh
học, người ta cho rằng các monoterpen không vòng có cấu tạo bất bình
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
thường đó được hình thành từ một tiền chất, tiền chất này được giả định là
chrysanthemyl pyrophosphat thông qua sự chuyển vị của ion

3
OH

CH
3
H
3
C CH
3
OH

CH=O
H
3
C CH
2
CH=O
H
3
C CH
3
α-Terpineol Menthol Perillaldehit Phellandral
CH
3
H
3
C CH
3
O


8
7
6
5
4
3
2
1
9

CH
3

(+)-cis-thujan (+)-trans-thujan β
1.1.2.2. Sesquiterpen
Các sesquiterpen thường xuất hiện trong các thực vật thượng đẳng, một
số Ýt cũng gặp trong giới thực vật hạ đẳng và trong giới động vật (như sâu
bọ). Đa số các sesquiterpen là các hidrocacbon không no (còn có cả một số
ankyl), còn lại là các alcohol, xeton,aldehit, axit cacboxylic. Ngoài ra, chúng
còn có thể có thêm vòng este từ ba đến bảy cạnh cũng như vòng furan. Ta
cũng cần kể đến các sesquiterpen được thế bởi clo hoặc brom và các hợp chất
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
nitơ có 15 nguyên tử C (các sesquiterpenancaloid). Từ một số các
sesquiterpen đã hình thành một số hợp chất với 12 hoặc 14 nguyên tử C (các
nor-sesquiterpen).
Gần đây người ta chó ý nhiều đến việc nghiên cứu các
sesquiterpenlacton, là chất phổ biến xuÊt hiện trong các cây thuộc họ cóc
(Compositae), tuy nhiên cũng có nhiều trong họ cây khác. Hợp chất đầu tiên
thuộc nhóm này được phân lập dưới dạng tinh thể là α-santonin (1930). Đến

3
C CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C CH
3
CH
3
CH
3
Nerolidol Zingiberen Bisabolen
Ngoài ra còn có rất nhiều sesquiterpen một vòng khác tiêu biểu là Zingiberen
và Bisabolan, xuất hiện khá đông đảo và phổ biến trong thiên nhiên.
H
HOH
2
C
HO
O
O
H
H

H
H

3
5
8
1

O
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
H

O
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3

đối với các kÝ sinh trùng sốt rét của người thì vẫn không chắc chắn. Sự tiếp
tục nuôi cấy in vitro các ký sinh trùng sốt rét người Plasmodium falciparum
đã dẫn đến một kĩ thuật cho việc đánh giá định tính về hoạt tính kháng các kÝ
sinh trùng này. Sự tiếp tục phát triển của kĩ thuật này rất tin cậy dựa vào việc
đo khả năng ức chế sự hợp nhất của
3
H-hypoxanthin vào trong trùng sốt rét.
Kĩ thuật này được ứng dụng dễ đánh giá hoạt tính của các dịch thô (etanol)
của Artermisia annua và A.vulgaris (cây ngải cứu). Thử nghiệm in vitro này
tách bạch giữa hai loại dịch chiết với giá trị IC
50
lần lượt là 3.9 µl/ml và 250
µl/ml. Artermisia annua được sử dụng trong việc điều trị bệnh sốt rét truyền
thống của Trung Quốc và chất thể hiện hoạt tính là artemisinin
(1)
mà chất này
không có trong A.vulgaris.
Điều đáng chú ý rằng hoạt tính chống sốt rét in vitro không song song
với việc thể hiện độc tính chống lại các tế bào KB (human epidernoid
carcinomax of the mouth). Bởi vậy một chất có hoạt tính gấp nhiều lần chất
kia trong việc thử nghiệm chống sốt rét nhưng lại có thể độc gấp 10 lần đối
với các tế bào KB.
1.2.1. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học được dùng cho sự phát
hiện thuốc có khả năng chống sốt rét.
1.2.1.1. Sàng lọc in vitro
Thông thường hai dòng P.falciparum được dùng để nghiên cứu, một
dòng nhạy đối với chloroquin như 3D7 và một dòng chống lại chloroquin như
Dd2. Các hồng cầu ngoại biên của máu người được sử dụng trong các nghiên
cứu sàng lọc in vitro. Các kÝ sinh trùng được thêm vào hồng cầu và nuôi cấy
ở 37

chuyển hoá các tetrazolium nitro xanh thành fomazan.
Một sù thay thế khác cũng thường được sử dụng để xác định khả năng
ức chế sự phát triển của kÝ sinh trùng là việc đếm các kÝ sinh trùng bằng
kính hiển vi. Các đốm bẩn mỏng của nuôi cấy kÝ sinh trùng nhận được sau
khi ủ Êm với các nồng độ dịch chất khác nhau hoặc các mẫu thử khác nhau
được nhuộm màu với Giemsa và kÝ sinh trùng được xác định như là phần
trăm của hồng cầu bị nhiễm.
Để thử hoạt tính của các mẫu thử trên các giai đoạn khác nhau của
hồng cầu, sự nuôi cấy xảy ra đồng thời đối với giai đoạn mới tạo vòng do
phân giải sorbitol. Các hồng cầu có kÝ sinh trùng được li tâm và viên rắn
được tạo huyền phù lại trong dung dịch D-sorbitol 5% trong 5 phút. Chúng
được phân lập bằng việc li tâm và thêm các hồng cầu vào trong các môi
trường nuôi cấy trong đó tối thiểu 90% các kÝ sinh trùng có cùng giai đoạn
phát triển. Sau đó có thể tiến hành thử các mẫu chống lại các giai đoạn hồng
cầu khác nhau của các kÝ sinh trùng bằng cách thêm chúng vào quá trình
nuôi cấy tại thời điểm thích hợp.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Sự chọn lọc của các phép thử sốt rét
Điều đặc biệt quan trọng cần biết khi tiến hành thử nghiệm là phương
pháp in vitro chỉ thể hiện kết quả nếu một hợp chất đã cho ức chế sự phát
triển của kÝ sinh trùng và nó không cho biết hợp chất này có độc hay không
nếu như hợp chất thử giết chết tất cả các tế bào bao gồm cả các tế bào chủ [9].
Để minh chứng cho vấn đề này một loạt các phép thử có hệ thống phải được
khảo sát. Điều thường xuyên gặp phải trong khi thử các hợp chất có khả năng
chống sốt rét là các hợp chất này lại thể hiện khả năng nghèo nàn trong việc
ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư (các tế bào KB). Một hợp chất có
khả năng ngăn ngừa cao sự phát triển của các kÝ sinh trùng trong in vitro
nhưng lại không ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư cũng nên được
quan tâm cho các nghiên cứu tiếp theo. Và sự phát triển một qui trình cho việc

Ngày thứ tư kể từ khi nhiễm, các vết bẩn mỏng được lấy từ đuôi chuột dùng
để xác định hàm lượng kÝ sinh trùng. Số chuột tử vong được xác định đến 28
ngày kể từ lần điều trị cuối cùng [10].
Để xác định hiệu lực của thuốc trong quá trình điều trị, máu từ chuột đã
điều trị được rót ra 28 ngày sau khi điều trị và được tiêm bằng đường ven vào
trong chuột mới. Hàm lượng kÝ sinh trùng và sự sống sót của chúng trong
động vật được xác định, việc không phát hiện thấy kÝ sinh trùng trong máu
14 ngày sau khi nhiễm chứng tỏ tác dụng chữa bệnh của hợp chất thử.
* Mô hình chuột cống
Các con chuột cống đã được gây nhiễm với 10
7
hồng cầu đã nhiễm kÝ
sinh trùng với dòng kÝ sinh trùng P.berghei được sử dụng. Mặt khác, các
thực nghiệm được tiến hành như đã mô tả ở phần trên đối với chuột nhắt.
Điều không thuận lợi ở các mô hình chuột.
Các chuyển hoá thuốc trong các động vật này khác với người và trong
chúng có hoạt tính huyết thanh giải độc cao. Sinh học của các loài kÝ sinh
trùng được thử trong các mô hình này là khác với sinh học của loài kÝ sinh
trùng ở người , ví dụ không có sự hình thành hypnozoid trong bất kì kÝ sinh
trùng của chuột nào. Độ mẫn cảm của kÝ sinh trùng của chuột khác với
người. Cuối cùng sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa thuốc và hệ thống miễn dịch
chủ trong hệ thống của chuột cũng khác với người.
b. Mô hình khỉ
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Các động vật có tay như các loài khỉ Aotus Lemurinus và Saimiri spp
nói chung thường được dùng để thử nghiệm hiệu lực chống sốt rét in vitro của
các thuốc có khả năng kháng kÝ sinh trùng sốt rét [11], các thử nghiệm cho
thấy chúng chống lại sự nhiễm kÝ sinh trùng P.falciparum. Giá cả chi phí
cũng như khả năng sẵn có của các loài khỉ làm cho mô hình này chỉ sử dụng

chủ yếu là artermisia keton, pinene, cineol và L-campho. Từ lâu, Artemisia
annua được dùng để chữa sốt, nóng, khát nước, phiền nhiệt ra mồ hôi, tối
nóng sáng mát, thận có chứng lao nhiệt, sốt rét cơn, bệnh vàng da và các bệnh
ngoài da. Từ lâu ngải hoa vàng cùng các chiết xuất của nó đã được dùng để
chữa bệnh sốt rét, với thành phần có hoạt tính chống sốt rét mạnh là
artemisinin. Ngày nay, chóng ta đã chọn được giống cây này cho năng suất
artemisinin cao (từ 3,5-5 kg/tấn) và có thể trồng được ở nhiều nơi trên đất
nước.
1.3.1. Artemisinin và hoạt tính kháng sốt rét.
Artemisinin là hoạt chất chính của cây ngải hoa vàng [13]. Vào thập kỉ
70, các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên đã chiết suất thành
công artemisinin trong cây này để làm thuốc chống sốt rét, một căn bệnh cướp
đi hàng triệu sinh mạng mỗi năm, chủ yếu ở các nước nghèo Châu Á, Châu
Phi.
Thập kỉ 90, các nhà khoa học Việt Nam và công ty dược liệu Trung
Ương I đã trồng hàng trăm hecta cây thanh hao hoa vàng, chiết suất hàng tấn
artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét từ
artemisinin như artesunat, artemether, arteeter. Các nhà khoa khọc cũng đã
sản xuất ra hàng triệu liều thuốc chống sốt rét cung cấp cho các nhu cầu trong
nước và xuất khẩu, thu về hàng triệu dola Mỹ mỗi năm. Đầu thế kỉ 21, cụm
công trình thanh hao hoa vàng đã được nhà nước trao giải thưởng Hồ Chí
Minh.
Artemisinin và các chế phẩm từ nó là loại thuốc tương đối an toàn. Ở
liều điều trị không độc, an toàn với phụ nữ có thai và những người suy gan,
suy thận LD = 5015 mg/kg thể trọng, điều này cho thấy artemisinin và các
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
dẫn xuất từ nó an toàn cho người sử dụng. Gần đây các nhà khoa học Mỹ đã
phát hiện ra khả năng chữa ung thư của artemisinin. Đây có thể được coi là
một trong những thành công có giá trị mang lại hy vọng lớn lao cho người

này phải nhập ngoại rất đắt tiền. Người bệnh nghèo không có đủ tiền để mua
đành chờ chết. Để thực hiện chính sách y dược học cổ truyền đến năm 2010
của Chính phủ, các nhà khoa học và ngành y tế đang quan tâm đến việc
nghiên cứu, sử dụng artemisinin và các dẫn xuất của nó để điều trị ung thư
ngoài việc chữa trị các bệnh sốt rét. Điều này thành công sẽ mở ra khả năng
tiềm tàng về việc sử dụng các chất có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là các
cây thuốc bản địa của Việt Nam để chữa trị các bệnh nan y với đặc tính ưu
việt sẵn có, rẻ tiền hơn nhiều so với các loại hoá trị liệu chữa ung thư hiện
dùng.
1.3.3. Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua
Mặc dù con đường sinh tổng hợp hoàn toàn artemisinin và một vài tiền
chất của nó đến nay vẫn chưa được thiết lập hoàn toàn [14,15], tuy vậy một
vài bước biến đổi sinh học cũng đã được minh chứng ở dạng in vitro và in
vivo (Hình 2). Akhila và các cộng sự đã đề nghị một con đường sinh tổng hợp
hoàn toàn artemisinin từ axit mevalonic và izopentenyl pyrophosphat. Thứ tự
sinh tổng hợp do nhóm này đưa ra như sau
Farnesylpyrophosphat → khung germacrane → dihidrocostunolide →
cadinanolid → arteanuin B → artemisinin.
Tuy nhiên khi nghiên cứu thành phần hoá học của cây Artemisia annua
các nhà khoa học thấy rằng hàm lượng axit artemisinic là tiền chất của
artemisinin, điều mà Akhila và các đồng sự đã không đưa ra trong báo cáo
của mình. Một điều lý thú khác, Eiferaly và các cộng sự cho công bố axit
artemisinic là tiền chất sinh tổng hợp ra cả arteannuin B và artemisinin. Wang
và các cộng sự đã chuyển hoá axit artemisinic có gắn nguyên tử
3
H tại C
15
(nhóm metylen exocyclic) thành cả arteannuin B và artemisinin. Ngoài ra một
số tác giả khác cũng cho rằng axit dihidroartemisinic cũng là tiền chất của
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001

(GPP), fanesyl pyrophosphat (FPP) và geranyl geranyl pyrophosphat (GGP),
nhờ các enzym đóng vòng này mà sự chuyển hoá thứ cấp xảy ra và tạo ra các
sản phẩm tương ứng là các monoterpen, sesquiterpen và diterpen nhờ rất
nhiều các phản ứng electrophin nói chung mà cơ chế đã được chỉ ra. Cũng
nhờ sự định hướng này mà rất nhiều các enzym đóng vòng đã được phân lập,
nhân dòng, biểu hiện trong thực vật và các vi sinh vật. Dưới đây là hoạt động
của một số enzym đóng vòng terpen.

Vetispiradiene
Germacrene C
OPP
H
δ-cadinene
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
5-epi-aristolochene
epi-cedron
Hình 3: Hoạt động của các enzym đóng vòng sesquiterpen
Farnesyl pyrophosphat được chuyển hoá thành các sesquiterpen khác nhau
bởi các enzym đóng vòng terpen.
Trên cơ sở các tài liệu tham khảo, khoá luận xoay quanh việc nghiên cứu
phân lập, xác định cấu trúc của các chất theo định hướng hoạt tính sinh học.
Mục tiêu của khoá luận được đưa ra như sau:
- Thu hái mẫu Artemisia annua và phân lập artemisinin.
- Xác định cấu trúc của sản phẩm phân lập được bằng các phương pháp
phổ hiện đại như IR, GC-MS,
1
H-NMR,
13
C-NMR và các phổ hai chiều.

+ Phát hiện vệt chất: Đèn UV 254 nm, dung dịch Iot/KI loãng dùng để phát
hiện các sesquiterpen lacton
+ Thử nghiệm hoạt tính chống sốt rét của artemisinin: phương pháp thử hoạt
tính chống sốt rét của artemisinin được tiến hành tại phòng hoá dược, Korea
Research Institute of Biosciene and Biotechnology.
+ Thiết bị
Thiết bị thuỷ tinh
-Bình cầu 2 lít ba cổ
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
-Phễu chiết Shoxlet
-Cột sắc kí
-Bình triển khai
-Máy cất quay chân không
-Cột sắc kí lỏng chân không, cột sắc kí đẩy, bản mỏng.
Các máy đo: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ hồng ngoại, máy phổ cộng
hưởng từ hạt nhân.
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THU HÁI MẪU
Lá của cây Artemisia annua trồng đại trà ở Mê Linh – Vĩnh Phúc được
thu hái vào tháng 6. Mẫu cây này được sấy ở 100
0
C trong 30 phút để diệt nấm
mốc, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40
0
C.
2.2. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT HỒI LƯU NÓNG
0,5 kg lá cây Artemisia annua được cho vào phễu chiết Shoxlet, phễu này
được gắn trên bình cầu 2 lít được đặt vào trong bếp đun hồi lưu chuyên dụng.
Phía trên của Shoxlet được lắp sinh hàn hồi lưu hiệu lực để sự thất thoát dung

O
3
, SiO
2
hoặc celite trước khi đưa lên cột.
2.3.2. Tiến hành chạy sắc kí lỏng chân không
Lượng dung môi sử dụng cho mỗi phân đoạn được tính toán theo thể
tích của lớp silicagel và mẫu. Với lượng mẫu từ 1-10g, phễu thuỷ tinh dùng
cho sắc kí có dường kính 5 cm, chiều cao lớp hấp phụ là 5 cm, từ đó thể tích
dung môi cho mỗi lần chạy đễ dàng được tính theo công thức.
V = πr
2
.h
Thay π = 3,14
r = 2,5 cm
h = 5 cm
Ta được: V = 98 cm
3
hay 98 ml.
Hình 5: Cột sắc kí lỏng chân không và Shoxlet
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Để bảo đảm tách toàn bộ các sesquiterpen ra khỏi dịch chiết, chúng tôi
chạy 20 phân đoạn với các tỷ lệ dung môi khác nhau (từ n-hexan/axeton:
100/0 → 94/6)
Các phân đoạn thu được để yên cho dung môi bay hơi hết, kiểm tra các
sản phẩm bằng sắc kí bản mỏng.
2.4. PHƯƠNG PHÁP CHẠY SẮC KÍ CỘT
Sản phẩm thu được từ phương pháp chạy sắc kí lỏng chân không vẫn
còn một số các terpen khác ngoài artemisinin, chẳng hạn như axit artemisinic,