Website: Email : Tel : 0918.775.368
Phần 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về Tobramycin
1.1.1. Công thức cấu tạo
C
18
H
37
N
5
O
9
PTL: 467.5
Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy--D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6-
diamino-2,3,6-trideoxy--D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nớc, rất khó tan trong
ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether.
Góc quay cực riêng []
D
20
: +138
0
đến +148
0
[7]
1.1.3. Nguồn gốc
Chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán
tổng hợp từ kanamycin B [7].
1.1.4. Dợc động học
Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt

hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam.
4
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -
Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc
benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ. [2]
1.1.7. Chống chỉ định
Ngời có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe
kém và ngời có bệnh thận. [2]
1.1.8. Dạng bào chế và liều lợng
Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời
lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ.
Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %.
Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P.
aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11]
1.2. Một số phơng pháp định lợng Tobramycin
1.2.1. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp vi sinh
1.2.1.1. Phơng pháp 1 [15]
- Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501.
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 0,1
Dikali hydrophosphat : 5,59 g
Kali dihydrophosphat : 0,41 g
- Môi trờng định lợng:
Pepton : 5,0 g
Cao thịt : 3,0 g
Dikali hydrophosphat : 3,0 g
Thạch : 15,0 - 20,0 g
Nớc cất : 1000 ml
pH sau khi tiệt trùng : 7,8 0,2
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả

(hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính
6
Website: Email : Tel : 0918.775.368
xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt
độ từ 5

C đến 15

C và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng
dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ
8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
- Dung dich thử:
Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực),
hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml.
Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc
các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
1.2.2. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-
VIS
1.2.2.1. Phơng pháp 1: [4]
Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin
nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất 2 lần
vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có
dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO
4
.
Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 40
0
C trong 60 phút.
Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối
chiếu tobramycin.

- Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tơng tự.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml.
1.2.2.2 Phơng pháp 2 [20], [23]
- Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm).
- Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong
khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N,
sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều.
- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen
1% trong ethanol 96%.
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Detector UV: 365 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch
acid sulfuric 0,004 N.
- Các dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4-
dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc khi tiêm sắc ký.
1.2.2.3 Phơng pháp 3 [15]
- Cột Purospher

STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 àm, Merck).
- Pha động: Acetonitril - nớc (50:50).
8
Website: Email : Tel : 0918.775.368
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút.
- Detector UV: 230 nm.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc.
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc
thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70
0

- Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38]
- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút.
- Thuốc thử tạo dẫn chất: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic.
9
Website: Email : Tel : 0918.775.368
- Detector UV: 340 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm
phosphat pH 7,4.
- Dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử acid
2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70
0
C.
1.2.2.6. Phơng pháp 6 [5]
- Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5àm)
- Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 àm
- Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat
và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm.
- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100
ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml dung
dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4
lắc đều.
- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml
nớc. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ
1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005).
1.2.2.7. Phơng pháp 7 [9]
Dung dịch thử

u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất.
Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt
tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất.
11
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích
các hợp chất phân cực và hấp thụ UV. Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu
nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc
biệt đắt tiền.
Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt
vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng
pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc
thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng
trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa
tobramycin.
1.3. Tổng quan về phơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di
chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in [8].
1.3.2. Cơ sở lý thuyết

Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách. Nếu
sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có tính chất
acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên
liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.
13
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.3.3.5. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ
UV - VIS.
Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt
động của phơng pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ,
huỳnh quang, điện hóa.
1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu
dới dạng pic [8], [14].
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 1.1
Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.4. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký
14
Cột
Binh
chứa
pha
động
Bơm
Detector Bộ phận tự ghi
Van tiêm
mẫu
Website: Email : Tel : 0918.775.368


(Thời gian lu thực): t
R

= t
R
- t
0
* W
0.5
: Độ rộng của pic ở nửa chiều cao.
* W
b
: Độ rộng ở đáy pic.
Thời gian lu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số
đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
1.3.4.1. Hệ số dung lợng k

[8],[14]
Nếu k' nhỏ thì
t
R
cũng nhỏ và sự
tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ đợc
tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân tích thờng chọn
cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8
1.3.4.2. Độ chọn lọc

(selectivity - factor)
15

(k
2
'
> k
1
'
) [8], [14]
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.
1.3.4.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:
=
R
( ) ( )

















20/1
=
[8], [14]
Trong đó:
W
1/20
: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng
cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lợng, yêu cầu: 0,9 AF 2 [1], [18], [22].
1.3.4.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cột.
N = 16






w
t
B
R
2
hay N=5,54