1 Ngày nay, để phòng tránh các căn bệnh hiểm nghèo, phát hiện các yếu tố lạ trong thực
phẩm cây trồng, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương
pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết và phương pháp hóa sinh, hoặc kết
hợp các phương pháp này. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Tuy nhiên,
phương pháp đơn giản, giá thành xét nghiệm rẻ và tương đối chính xác, được phổ biến
hiện nay là ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - xét nghiệm hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme.
Hà Nội, 14/4/2012
I. Giới thiệu phương pháp ELISA
1. Lịch sử phát triển
Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp
miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định kháng nguyên,
kháng thể . Trong phương pháp này, kháng thể hay kháng nguyên có gắn chất đánh dấu
phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ. Tuy vậy,
các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp
mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ. Khi đó người ta đã biết rằng
một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như
Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ phát màu. Màu sinh
ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị).
Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như chất phóng xạ trong radioimmunoassay, tín
hiệu màu phát ra phải đồng nghĩa với sự có mặt của kháng thể hay kháng nguyên. Chính
vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với kháng nguyên hay kháng thể.
Kỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể được phát triển bởi Stratis
Avrameas và G.B. Pierce . Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương
pháp gắn kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các
đĩa) nhờ đó mà kháng nguyên hay kháng thể không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa
trôi.
Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van


Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở
một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA-
Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính
xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi
khuẩn, nấm, kí sinh.
Ưu điểm:
+Dễ thực hiện
+ Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu
+ Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE
Hạn chế:
+ Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h)
+ Thiết bị mắc tiền
II. Phân loại
1. Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát
hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể
duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme).
Quy trình thực hiện:
4

Ưu nhược điểm:
 Ưu điểm:
+ Đơn giản nhất, Nhanh chóng bởi vì chỉ có một kháng thể và trải qua ít bước
hơn.
+ Phản ứng của kháng thể thứ cấp được loại bỏ.



được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết
thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước
này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của
các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng
thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của
huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ
một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện
kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay
tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Ưu nhược điểm:
 Ưu điểm:
+ Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng
gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các
protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA
hạn chế được nhược điểm này.
+ Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên
nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
+ Linh hoạt bởi vì các kháng thể nhiều chính có thể được thực hiện trong một loài
và cùng một kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng để phát hiện.
+ Độ nhạy sáng được tăng lên bởi vì mỗi kháng thể chính chứa các epitope một số
có thể được ràng buộc bởi các kháng thể thứ cấp , cho phép khuếch đại tín hiệu.
 Nhược điểm:
+ Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả
khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng

4. ELISA cạnh tranh
Quy trình thực hiện:
+ “Ủ” kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên.
+ Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên.
+ Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên càng lớn,
lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do “cạnh tranh”
9 + Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thể ở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn
với enzym.
+ Thêm cơ chất. Lượng enzym dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu màu.
Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng
yếu.
III. Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp
1. Ảnh hưởng đến độ nhạy
 Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng
 Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
 Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
2. Ảnh hưởng đến kết quả
 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo
màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.
 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải
kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải
kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu.
 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể
kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi
một yếu tố thí nghiệm.

-Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở
phổi chuột gây ra.
- Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên.

VI. Ứng dụng của ELISA trong xét nghiệm HIV
1. Về HIV/AIDS
11 AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc
phải gây ra bởi HIV (Human Immuno-Deficiency virus)
AIDS xảy ra do sự tấn công HIV vào tế bào của hệ miễn dịch. Trước hết là làm suy giảm
số lượng và rối loạn chức năng của tế bào miễn dịch dẫn dến hàng loạt rối loạn khác của
hệ miễn dịch, gây ra suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng cơ
hội phát triển, cuối cùng là tử vong.
Cấu trúc HIV:
HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc
gồm 3 lớp.
- Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng
nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú, đó là các phân tử Glycoprotein có
trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần:
+ Glycoprotein màng ngoài :có trọng lượng phân tử là 120 kilodalton (gp120). GP120 là
kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin
phòng bệnh.
+Glycoprotein xuyên màng: có trọng lượng phân tử 41 kilodalton.
- Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:
+ Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18).
+ Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton
(p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS
- Lõi: Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:

Sinh phẩm thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp hoặc protein tổng
hợp. Sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.
Sinh phẩm thế hệ ba xử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp và các proteine tổng hợp
nhưng kháng thể được phát hiện theo nguyên tắc ELISA sandwich. Độ nhạy và độ đặc
hiệu được cải thiện rõ rệt.
Sinh phẩm thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu
thử. Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trước khi có sự chuyển đổi huyết
thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyền
máu.
Các sinh phẩm ELISA ngày càng được hoàn thiện để có thể phát hiện sớm và chính xác
13 kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết thanh. Các sinh phẩm dùng các
kháng nguyên có các epitop tạo ra các kháng thể sớm và có các loại kháng nguyên cho
phép phát hiện kháng thể kháng virút HIV 1 & 2, các thứ type virút và các virút HIV
nhóm O.
3. Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV
3.1. Nguyên tắc
Là phản ứng ELISA “Sandwich “ một bước.
- Kháng nguyên gắn trên giếng là các protein vỏ gp160 của HIV-1 và ANT70 (nhóm O);
gp36 của HIV2
- Nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu với kháng
nguyên cố định trên giếng. Đồng thời khối cầu cộng hợp là kháng nguyên HIV gắn men
cũng có sẵn trong mỗi giếng sẽ tạo phức hợp kẹp chả: Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng
hợp.
- Phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp sẽ được phát hiện bằng phản ứng hiện
màu với cơ chất
3.2. Quy trình thực hiện
14

3 – 6 tháng. 16 Kết luận
ELISA là một phương pháp có nhiều ưu điểm nổi trội so với các phương pháp khác, cho
phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu, dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm
xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm, kết quả đọc bằng máy không phụ thuộc vào chủ
quan của người làm xét nghiệm nên kết quả đo được có độ chính xác cao. Hơn nữa giá
thành xét nghiệm rẻ, thời gian thu được kết quả không quá lâu. Vậy nên phương pháp
này nên được sử dụng phổ biến rộng rãi để nâng cao kết quả điều trị bệnh, năng suất cây
trồng cũng như chất lượng thực phẩm của xã hội. Đặc biệt, ELISA giúp xét nghiệm
HIV/AIDS – căn bệnh thế kỉ của con người.
Trong quá trình làm tiểu luận này, hẳn vẫn còn nhiều thiếu sót do hạn chế về kiến thức
cũng như thời gian, vì vậy, rất mong cô giáo và các bạn giúp đỡ để tiểu luận được hoàn
thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
17


3. Sandwich ELISA 7
3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 7
3.2 Sandwich ELISA gián tiếp 8
4. ELISA cạnh tranh 8
III. Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp 9
1. Ảnh hưởng đến độ nhạy 9
2. Ảnh hưởng đến kết quả 9
IV. Một số thiết bị sử dụng trong phương pháp ELISA 9
V. Ứng dụng 10
1. Trong thực phẩm 10
2. Trong nông nghiệp 10
3. Trong y học 10
VI. Ứng dụng của ELISA trong xét nghiệm HIV 10
1. Về HIV/AIDS 10
2. Nguyên lý của phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV 11
3. Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV 13
3.1. Nguyên tắc 13
3.2. Quy trình thực hiện 13
4. Ưu điểm và hạn chế 14
5. Các kết quả bất thường 15
Kết luận 16
Tài liệu tham khảo 17