BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG NGỌC NÃI
TỔNG HP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CÁC DẪN XUẤT
QUANG HOẠT CIS-N-ALKYL PHTHALAZINON
CÓ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC
TP. Hồ Chí Minh - Năm 2015
i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Chương Ngọc Nãi
iii MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình x
Danh mục các sơ đồ xiii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Đồng phân quang học 3
1.2 Enzym phosphodiesterase và mô hình gây viêm thực nghiệm 10
1.3 Dẫn xuất phthalazinon 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1 Đối tượng nghiên cứu 31
2.2 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bò 33
2.3 Phương pháp nghiên cứu 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45
3.1 Tổng hợp các dẫn xuất cis-N-alkyl phthalazinon 45
3.2 Xác đònh độ tinh khiết quang học bằng phương pháp HPLC với pha tónh bất
đối 71
3.3 Thử tác dụng kháng viêm in vivo 85

Cyclic guanosine monophosphate
Guanosin monophosphat
vòng
C
Concentration
Nồng độ
CE
Capillary electrophoresis
Điện di mao quản
COPD
Chronic Obstructive Pulmonary
Disease
Bệnh phổi tắc nghẽn
mạn tính
COSY
Correlation spectroscopy
Phổ tương quan giữa
proton-proton
CTCT

Công thức cấu tạo
CTPT

Công thức phân tử
DĐVN

Dược điển Việt Nam
DMF
Dimethylformamide
Dimethylformamid

cao
HSQC
Heteronuclear single quantum
cohenrence
Phổ tương tác dò nhân
qua một lượng tử
IC
50

Half maximal inhibitory
concentration
Nồng độ ức chế 50%
ICH

International Conference on
Harmonization
Hội nghò quốc tế về hòa
hợp
IR
Infrared
Hồng ngoại
KLPT

Khối lượng phân tử
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn đònh lượng

o
ncNhiệt độ nóng chảy
tt

Thể tích

vii DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Một số tác nhân bất đối được sử dụng phổ biến 5
Bảng 1.2 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 của các dẫn xuất 4-(3,4-dimethoxy
phenyl)-2H-phthalazinon 17
Bảng 1.3 Dữ liệu phân giải acid cis-cyclohex(a)en -ceto 20
Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 của các dẫn xuất thế 4-aryl hexahydro-
phthalazinon và tetrahydrophthalazinon 21
Bảng 1.5 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 và tác dụng kháng viêm in vivo của các
dẫn xuất thế N-H tetrahydrophthalazinon 22
Bảng 2.1 Danh mục các hợp chất nghiên cứu 31
Bảng 2.2 Các điều kiện sắc ký khảo sát 38
Bảng 3.1 Khảo sát hệ dung môi kết tinh lại hợp chất 3 sau 6 giờ 46
Bảng 3.2 Khảo sát thời gian kết tinh lại hợp chất 3 trong n-hexan - ethyl acetat
(1:1) 46
Bảng 3.3 So sánh khả năng tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b giữa hai tỉ lệ dung
môi n-hexan - isopropanol (90:10) và (95:5) với tốc độ dòng 0,5 ml/phút 72
Bảng 3.4 So sánh khả năng tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b giữa hai tỉ lệ dung

Bảng 3.21 Góc quay cực riêng của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 97
Bảng 3.22 Tỉ lệ tạp đồng phân quang học của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b tính
theo phần trăm diện tích pic 97
Bảng 3.23 Tỉû lệ tạp chất liên quan của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b tính theo
phần trăm diện tích pic 98
ix Bảng 3.24 Kết quả xác đònh dung môi tồn dư của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 98
Bảng 3.25 Kết quả xác đònh hàm lượng nước của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b . 98
Bảng 3.26 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 7b 99
Bảng 3.27 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 8b 99
Bảng 3.28 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 9b 100
Bảng 3.29 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 10b 100
Bảng 3.30 Kết quả xác đònh độ tinh khiết quang học của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b,
10b 101
Bảng 3.31 Mức chất lượng đề nghò của các dẫn xuất quang hoạt 7b, 8b, 9b,
10b 101
x DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của enzym phosphodiesterase 11
Hình 1.2 Một số chất ức chế chọn lọc enzym PDE 4 12
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử carrageenan 13
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của phthalazinon 15
Hình 1.5 Cấu trúc chung của hợp chất có hoạt tính ức chế kép PDE 3/ PDE 4 23
Hình 1.6 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu
Demirayak S. 23

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl tetrahydro-
phthalazinon và cis-N-alkyl hexahydrophthalazinon 31
Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn hợp sau phản ứng khi so sánh lượng natri hydrid xúc tác
phản ứng N-alkyl hóa với heptyl bromid 56
Hình 3.2 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 7b 59
Hình 3.3 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 8b 62
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của các dẫn xuất 7, 7a, 7b, 8, 8a, 8b 63
Hình 3.5 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 9b 67
Hình 3.6 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 10b70
Hình 3.7 Công thức cấu tạo của các dẫn xuất 9, 9a, 9b, 10, 10a, 10b 71
Hình 3.8 Phân tách 8b bằng pha động (a) n-hexan - ethanol (90:10), (b) n-hexan
- isopropanol (90:10) 71
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 81
xii Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu (a) 7a 100 g/ml (b) 7b 100 g/ml (c) 7 100
g/ml 81
Hình 3.11 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 7a (b) 7b 81
Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu (a) 8a 100 g/ml (b) 8b 100 g/ml (c) 8 100
g/ml 81
Hình 3.13 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 8a (b) 8b 82
Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu (a) 9a 100 g/ml (b) 9b 100 g/ml (c) 9 100
g/ml 82
Hình 3.15 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 9a (b) 9b 82
Hình 3.16 Sắc ký đồ của mẫu (a) 10a 100 g/ml (b) 10b 100 g/ml (c) 10 100
g/ml 82
Hình 3.17 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 10a (b) 10b 83
Hình 3.18 Độ sưng phù chân chuột của các lô chứng, đối chứng, dẫn xuất 8a, 8b,
8 ở liều 30 mol/kg và 60 mol/kg 85

Sơ đồ 3.5 Phản ứng N-alkyl hóa phthalazinon với benzyl clorid 64
1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Dược chất quang hoạt là một trong những quan tâm chính của ngành công
nghiệp dược trong hai thập kỷ qua. Tác dụng sinh học của thuốc đôi khi chỉ thể
hiện ở một trong những dạng đồng phân quang học riêng lẻ. Trong một vài
trường hợp, các tác dụng phụ không mong muốn hoặc thậm chí độc tính có thể
xảy ra với những đồng phân quang học không có hoạt tính. Điển hình như [29]:
thalidomid ở dạng hỗn hợp racemic nhưng chỉ có dạng (R)-thalidomid có tác
dụng an thần, còn (S)-thalidomid không có tác dụng an thần nhưng lại gây quái
thai. Cả hai đối quang cũng có thể có tác dụng sinh học giống nhau nhưng tỉ lệ
hoạt tính rất khác nhau. Chẳng hạn, các chế phẩm chứa (S)-amlodipin, (S)-
omeprazol, levofloxacin, levocetirizin… có hoạt tính mạnh hơn dạng racemic và
đối quang tương ứng [12], [29], [55], [83]. Để tránh những tác dụng không mong
muốn có thể có của một dược phẩm quang hoạt, thuốc dạng đồng phân quang
học tinh khiết có hoạt tính trò liệu nên được đưa ra thò trường. Tuy nhiên, một số
lượng lớn các loại thuốc chứa dược chất quang hoạt vẫn còn trên thò trường ở
dạng racemic. Do đó, nhu cầu để phát triển công nghệ cho phân tích và tách
riêng đồng phân quang học của các thuốc racemic là rất lớn. Đây cũng là
nguyên nhân làm cho các cơ quan quản lý ở các nước Châu Âu, Mỹ và Nhật yêu
cầu ngành công nghiệp dược phải đưa ra thò trường các thuốc mới ở dạng đồng
phân quang học riêng lẻ [29], [57]. Điều này dẫn đến sự phát triển đáng kể
trong nỗ lực nghiên cứu tổng hợp các chất đối quang mới, tìm kiếm những tác
nhân, tối ưu hóa qui trình tổng hợp để cho sản phẩm đồng phân chọn lọc đối
quang tinh khiết. Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu sau
tổng hợp là vô cùng quan trọng để sản xuất thuốc có chất lượng tốt, hạn chế tối
đa những tác dụng phụ cho người sử dụng. Vì thế, việc nghiên cứu một cách hệ


CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC
1.1.1 Đồng phân quang học
Các đối quang là hình phản chiếu của nhau, không chồng khít lên nhau, tính
chất vật lý (điểm chảy, điểm sôi, chỉ số khúc xạ, tính tan) và tính chất hóa học
giống nhau. Các đối quang có tính quang hoạt gọi là đồng phân quang học
(enantiomer). Nếu phân tử chỉ có một nguyên tử carbon bất đối thì chỉ tồn tại
một đôi đối quang, còn khi trong phân tử có ít nhất 2 carbon bất đối thì mới có
được đồng phân lập thể không đối quang (diastereoisomer). Khác với các đối
quang, đồng phân quang học không đối quang không cùng mức năng lượng,
hằng số vật lý (nhiệt độ kết tinh, nhiệt độ sôi, độ phân cực, các tính chất phổ)
cũng khác nhau. Những giá trò này là cơ sở để tách các đối quang [3], [61].
1.1.2 Phương pháp tách riêng đối quang
Đa số các phản ứng tổng hợp thường tạo ra hỗn hợp racemic. Đó là trường hợp
nếu chất phản ứng, tác nhân, chất xúc tác được sử dụng là một racemic và/ hoặc
chất không bất đối. Hỗn hợp racemic có thể tách thành hai đối quang. Quá trình
tách riêng các đối quang ra khỏi hỗn hợp racemic gọi là sự phân giải racemic.
Có nhiều phương pháp tách riêng đối quang.
1.1.2.1 Phương pháp vật lý
Dựa vào tính chất vật lý khác nhau của sự kết tinh riêng biệt hai tinh thể đối
quang như trường hợp muối natri amoni tartrat hoặc phương pháp kết tinh “tự
phát”. Phương pháp này rất đơn giản nhưng không phải luôn luôn áp dụng được
cho bất kỳ một racemic nào [29], [42], [53].
4 1.1.2.2 Phương pháp hóa học
Hiện nay, phương pháp này được sử dụng hữu hiệu nhất để có thể tổng hợp và

điều kiện phân tách.
- Tác nhân bất đối phải tinh khiết quang học, dễ kiếm hoặc dễ điều chế, không
độc hại, rẻ tiền và dễ thu hồi sau khi đã hoàn thành sự phân đôi.
Việc lựa chọn dung môi thích hợp dùng để làm môi trường kết tinh là quan trọng
hàng đầu. Đa số dung môi thường sử dụng là nước, alcol, aceton và ethyl acetat
[28].
Bảng 1.1 Một số tác nhân bất đối được sử dụng phổ biến [5], [46]
Tác nhân bất đối acid
Tác nhân bất đối base
() Acid tartaric
(+) Acid tartaric
(+)-1-Phenylethylamin
()-1-Phenylethylamin
(+) Acid dibenzoyl tartaric
() Acid dibenzoyl tartaric
(+) Ephedrin
() Ephedrin
(+) Acid mandelic
() Acid mandelic
(+)-2-Amino-1-butanol
()-2-Amino-1-butanol
(+) Acid camphoric
() Acid camphoric
(+) Quinin
() Quinidin
(+) Acid malic
() Acid malic
() Cinchonidin
(+) Cinchonin
(+) Acid 1-camphor-10-sulphonic

phương pháp phải nhạy, đúng và tin cậy. Độ tinh khiết quang học có thể biểu thò
ở 3 khái niệm [9], [29], [66]:
- Độ tinh khiết quang học (optical purity)
Độ tinh khiết quang học
 
 
100
max
đo
20
D
20
D




(1.1)Trong đó:
 
đo
20
D

: là góc quay cực riêng của đối quang cần xác đònh đo được

 
max

- Độ tinh khiết quang học theo sắc ký (chromatography purity)
Độ tinh khiết quang học theo sắc ký
 
   
100


SR
R
(1.3)
1.1.3.2 Các phương pháp xác đònh độ tinh khiết quang học
Có thể xác đònh độ tinh khiết quang học bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Phương pháp đo góc quay cực riêng
Đo góc quay cực riêng chỉ được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết, đònh tính,
ngoài ra không thể sử dụng trong đònh lượng cũng như tách các đồng phân quang
học [14], [31].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Để tách các đồng phân quang học bằng phương pháp SKLM, có thể sử dụng một
trong các cách sau: phân tách trên pha tónh bất đối, phân tách trên pha tónh thông
thường thêm tác nhân bất đối vào trong dung môi rửa giải và phân tách trên pha
tónh không bất đối tạo dẫn xuất không đối quang bằng cách cho phản ứng giữa
mẫu thử với tác nhân bất đối. So với các phương pháp sắc ký khác thì SKLM còn
nhiều hạn chế (độ lặp lại thấp của trò số R
f
do ảnh hưởng của điều kiện sắc ký
và không thể thực hiện chương trình rửa giải trong quá trình triển khai sắc ký),
không thuận lợi cho quá trình tách và đònh lượng các dạng đồng phân quang học
[4], [9], [14], [29].
8


cũng tách được cho tất cả các dạng đồng phân [29], [31].
9 Hiện nay, Dược điển Mỹ 36, Dược điển Anh 2013 đã ứng dụng phương pháp
HPLC dùng pha tónh bất đối để xác đònh tạp đồng phân quang học trong một số
chuyên luận nguyên liệu như dexclorpheniramin, lamivudin, timodol,
clopidogrel… Trong điều kiện các phòng thí nghiệm ở nước ta, việc tách và phân
biệt các đồng phân đối quang còn là vấn đề mới, chưa được triển khai.
Phương pháp điện di mao quản (CE)
Mặc dù CE là một kỹ thuật phân tích hiện đại còn khá mới ở Việt Nam nhưng đã
phát triển mạnh ở các nước trên thế giới. Nhiều nhà nghiên cứu đã ứng dụng
phương pháp CE với các kỹ thuật như: điện di mao quản vùng, sắc ký mao quản
mixen điện động để tách đồng phân quang học của các hợp chất ibuprofen,
cloramphenicol, các corticoid, amlodipin, clorpheniramin… bằng cột mao quản có
bao tác nhân bất đối hoặc bằng cột mao quản silica nung chảy thông thường,
trong trường hợp này phải sử dụng các tác nhân bất đối thêm vào dung dòch điện
ly nền. Các tác nhân đó có thể là

,

,

-cyclodextrin, vòng ether đối quang,
muối mật, đồng (II) aspartat hay một số tác nhân bất đối chuyên biệt cho các
dạng đồng phân, thường là các dẫn xuất của cyclodextrin như: hydroxypropyl-

-
cyclodextrin, sulfobutyl ether-


hấp thụ ánh sáng của vòng ánh sáng phân cực quay trái và vòng ánh sáng quay
phải. Độ hấp thụ ánh sáng quay phải sẽ lớn hơn (giá trò dương) độ hấp thụ ánh
sáng quay trái (giá trò âm) [29], [31].
1.2 ENZYM PHOSPHODIESTERASE VÀ MÔ HÌNH GÂY VIÊM THỰC
NGHIỆM
1.2.1 Sơ lược enzym phosphodiesterase (PDE)
PDE là enzym điều hòa nồng độ cAMP và cGMP thông qua quá trình thủy phân
của các chất truyền tin thứ cấp này trong tế bào, biểu thò bằng sự ức chế hay
cảm ứng đặc trưng (co hay giãn cơ). Cho đến nay, có 21 gen PDE ở động vật có
vú và được phân làm 11 họ gọi là PDE 1-11. Trong đó, các enzym PDE 4, PDE 7
và PDE 8 chọn lọc cho cAMP; các enzym PDE 5, PDE 6 và PDE 9 chọn lọc cho
11 cGMP. Những họ khác tác động không chọn lọc cho cả cAMP và cGMP [41],
[45], [64]. Nucleotid vòng đóng vai trò quan trọng trong vô số các chức năng tế
bào bao gồm sự miễn dòch và đáp ứng viêm, hoạt động tim như nhòp tim và co
bóp, năng lượng hằng đònh nội môi, chất lỏng cân bằng nội môi, kích thích thò
giác, trầm cảm, nhận thức, sự rụng trứng và sự chết tế bào [80]. Vì vậy, enzym
PDE là một trung tâm điều hòa nồng độ nội bào của những nucleotid vòng, được
coi là mục tiêu dược lý của những liệu pháp điều trò các bệnh khác nhau, như
suy tim xung huyết, chứng đau chân khập khiểng, rối loạn chức năng cương
dương, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen suyễn, trầm cảm và tâm thần
phân liệt [72], [82].
Ngày nay, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự ức chế chọn lọc enzym PDE 4 vì
PDE 4 là enzym biểu hiện rõ trong những tế bào viêm [45], [71]. Trong đa số
các tế bào viêm và các tế bào miễn dòch, sự ức chế đáp ứng tế bào có liên quan
đến việc tăng mức độ của cAMP. Ức chế enzym PDE, đặc biệt là enzym PDE 4
sẽ làm tăng nồng độ cAMP, do đó làm tế bào mast giảm tiết các chất trung gian
gây viêm như histamin, cytokin, prostaglandin giúp làm giãn cơ trơn, từ đó