Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
1. Phần 1: Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế. Nghề trồng hoa cây cảnh đã đem
lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Sản
xuất hoa lan mang lại nhiều lợi nhuận bởi giá trị kinh tế và thẩm mỹ của nó. Nó
đã thực sự trở thành sản phẩm chiếm u thế trên thị trờng, thúc đẩy sản xuất kinh
doanh đặc biệt ở các nớc nh Thái Lan, Singapo, Malaixia... ở Thái Lan, kim
ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành năm 1991 đạt 30 triệu USD, Singapore mỗi
năm thu lợi nhuận từ lan cắt cành 10 triệu USD. Kim ngạch xuất khẩu hoa lan
trên thế giới hàng năm đạt 1,8 tỷ USD [13].
Việt Nam là một quốc gia có hệ thống rừng với độ che phủ lớn, khí hậu
nhiệt đới ẩm gió mùa phù hợp nhu cầu sinh thái của các loài lan. Mặt khác nớc
ta nằm trong trung tâm khởi nguồn của nhiều loài lan quý, có tiềm năng to lớn
nguồn cây dại và quỹ gen phong phú. Các vùng nh Sapa, cao nguyên Mộc Châu,
Ba Vì, Đà Lạt... thích hợp cho sự phát triển nhiều loài lan phục vụ công tác
chọn tạo giống cây trồng. Tuy nhiên chúng ta còn gặp những khó khăn bởi thiên
tai diễn biến bất thờng, nạn khai thác rừng tràn lan, nhiều loài lan quý có nguy
cơ tuyệt chủng, hệ sinh thái tài nguyên ngày càng cạn kiệt.
Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) mặc dù số lợng ít nhng với
vẻ đẹp tự nhiên là loài có hoa tự dài nhất, hoa to và bền, màu sắc nâu tím, cánh
môi vàng sẫm, số lợng hoa trên chùm có thể lên tới 15,5 hoa, nó đã thực sự thu
hút ngời tiêu dùng trong và ngoài nớc. Nhng khả năng đậu quả trong tự nhiên
lại rất thấp. Việc nghiên cứu tìm ra nhân giống in - vitro cho loài địa lan này
còn cha đợc nghiên cứu đầy đủ. Để khôi phục phát triển lan bản địa nhằm bảo
tồn nguồn gen phục vụ cho lai tạo lan rừng trong tơng lai, tạo ra nhiều loài đặc
hữu ở Việt Nam là một vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu giải quyết. Xuất phát từ
yêu cầu thực tế trên, chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân
K9 Khoa Công nghệ sinh học
1
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh

Đông, theo Bretchacider thì từ đời vua Thần Nông (2800) trớc công nguyên, lan
rừng này đợc dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó cùng với vẻ đẹp và tác dụng
chữa bệnh. Robut Bron (1773 1858) là ngời đầu tiên đã phân biệt rõ ràng
giữa họ lan và các họ khác [1, 2, 3, 4, 9, 10, 23]. Joanlind (1979 1985) là ng-
ời đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan. Năm 1836, ông công bố sắp xếp
các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ông
đa ra đựơc dùng cho đến ngày nay (Trần Hợp 1990) [10]. Họ lan có mặt ở
hầu hết các vùng trên trái đất, nhng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt
đới [20], nó đứng thứ hai sau họ cúc, khoảng 15000-35000 loài, phân bố từ 68
độ vĩ bắc

cho đến 56 vĩ độ nam. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên
các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam á (Mau RFL 1983)
[23]. Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium
ensifonymum là một loài bán địa lan. ở châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ
thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời
bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó
đến Bạch cập, Hạc đính rồi kiến lan, lan chính thức gia nhập vào ngành hoa
cây cảnh trên thế giới 400 năm nay.
ở Việt Nam, có lẽ ngời đầu tiên khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas
Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào nha, ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần
đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn Flora cochin chinensis gọi tên các cây lan
trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là aerides, phaius và
sarcopodium mà đã đợc Ben tham và Hooker ghi lại trong cuốn Genera
K9 Khoa Công nghệ sinh học
3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
plante rum (1862 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp 1995) [11],
chỉ sau khi ngời Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu đ-
ợc công bố đáng kể là F. Gagne Pain và A. Gui Ilaumin mô tả 70 chi gồm 101

tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nớc và chất dinh dỡng để nuôi cây trong
hoàn cảnh khô hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng,
nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp.
2.1.2.3. Lá lan
Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng, lá nửa đứng, lá cong rũ. Hầu hết
các loại địa lan đều là cây tự dỡng, là xơng chế tạo chất dinh dỡng bằng
quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc, hoặc
xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. Hình dáng lá thay
đổi từ loại lá mọng nớc, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn hay có
rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dới sát gốc thờng tiêu giảm đi
chỉ còn những bẹ không có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy. Các loài địa
lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể đến Đông lan
(2,6 lá/ nhánh). trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/ nhánh rất lớn
(9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá dài phải kể đến
Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm. Thanh ngọc (Cymbidiumensifolium)
40- 80 cm.
Về màu sắc, phiến lá thờng có màu xanh bóng nh các chi Lan kiếm
(Cymbidium. SW), chi lan Bầu rợu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh đậm
nh Hạc Đính Vàng (P. flavum).
2.1.2.4. Hoa lan
Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng. Ta có thể gặp nhiều loài mà
mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm
một bông. Mặc dù muôn hình muôn vẻ nhng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ cây
lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc trng
của lớp một lá mầm, nhng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt
phẳng.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
5
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
Mầm hoa của địa lan đợc hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của

chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi
vỏ này bị mục nát.
2.1.2.6. Hạt lan
Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thớc hạt vô cùng nhỏ với khối lợng toàn bộ
hạt trong một quả bằng 1/10-1/1000 mg trong đó không khí chiếm 76-96% thể
tích của quả. Do đó hạt lan hầu nh không có khối lợng. Hạt chỉ cấu tạo từ một
khối cha phân hoá, trên một mạng lới nhỏ xốp chứa đầy không khí. Phải trải
qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thờng chết vì khó gặp nấm cộng sinh
cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất xa, nhng hạt nảy
mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già ẩm ớt, vùng nhiệt đới
mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.
2.1.3. Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa
Địa lan Hồng hoàng (Hoàng lan) tên khoa học là Cymbidium iridioides,
có giả hình tròn dài, lá song đính, phiến hình gơm, dài 30-90 cm , rộng 2-3cm,
mầu xanh đậm. Chùm dài hơn lá, hoa to rộng đến 10 cm, màu lục vàng hay
vàng, môi thuỳ cạnh chóp nhọn, thuỳ giữa có đốm sậm hay vàng, bìa rất dúm có
lông. Nang dài từ 8-10cm [9].
Lá dài gần 70 cm hoa nở vào tháng 4, tháng 6, số lá trung bình / nhánh là
5,1. Loại địa lan này chỉ đẻ một lần/ năm, đẻ hai đợt mầm trong năm, tháng 3- 4
và tháng 9-10, những mầm đẻ vào tháng 9-10 thờng là mầm sinh trởng phát
triển kém, còi cọc, những mầm này khó có khả năng cho hoa. Tốc độ sinh trởng
về chiều cao của địa lan chậm, nhanh nhất là tháng thứ 6 mới đạt chiều cao tối
đa [14].
2.1.4. Yêu cầu về ngoại cảnh của cây lan
Để sinh trởng và phát triển tốt chúng vẫn cần có các yếu tố ngoại cảnh
nh nơi xuất xứ. Muốn nuôi dỡng tốt hoa lan trớc tiên chúng ta cần tìm hiểu đặc
tính sinh trởng của nó.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh

vờn lan. ẩm độ này do điều kiện địa lý, địa hình nói chung quy định.
- Độ ẩm của vờn: Là ẩm độ của chính vờn lan, độ ẩm này có thể cải
tạo theo ý muốn của ngời trồng lan.
- Độ ẩm trong chậu trồng lan: Gọi là ẩm độ cục bộ, do cấu tạo của giá
thể, thể tích chậu, số lần tới quyết định. ẩm độ này phụ thuộc hoàn toàn
vào kỹ thuật của ngời trồng lan. Đối với Địa lan thì ẩm độ này trong
khoảng 50 - 70% [7].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
8
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.1.4.3. ánh sáng
Nh chúng ta đều biết, sự phát triển của cây tăng theo tỷ lệ với cờng độ
ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến mức độ nhất định và khi vợt mức độ đó nó
sẽ ngừng tăng trởng. Do đó cần đặc biệt chú ý tới ánh sáng cho tất cả các loại
cây lan. Cần thiết phải làm giàn che nắng cho cây, tùy thuộc vào từng loài mà
có chế độ che nắng cho thích hợp. Tuyệt đối không để cho ánh nắng trực tiếp
chiếu vào cây, kể cả những tia nắng xiên. Khi chuyển chậu, thì phải chuyển
sang chỗ có ánh nắng nhiều hơn, nhng không quá 60% độ nắng. Tận dụng ánh
nắng buổi sáng, hạn chế ánh nắng buổi chiều. Nếu cần, che hoàn toàn ánh nắng
buổi tra, từ 12 giờ đến 14-15 giờ vào những ngày quá nắng. Đặc biệt đối với
những cây lan dới 2 tháng thì việc điều chỉnh cờng độ và thời gian chiếu sáng
trong ngày phải thực hiện chu đáo và linh hoạt phải cho chúng làm quen dần với
ánh nắng ngày càng tăng đến mức chúng có thể chịu đựng nổi [22].
2.1.4.4. Dinh dỡng
ở các nớc công nghiệp trồng lan phát triển, ngời ta dùng nhiều loại phân
bón, trong đó ngoài 3 chất chủ yếu là N (đạm), P (lân) và K (kali), ngời ta còn
bổ sung các nguyên tố đa lợng, vi lợng thích hợp với lan.
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu vấn đề dinh dỡng cho lan rất kỹ. Họ
khuyên nên bón nhiều N khi cây phát triển và khi kết thúc thời kỳ phát triển thì
nên bón nhiều P và K. Bón nhiều lần thật loãng bao giờ cũng tốt hơn bón ít lần

Lan rất sợ các luồng gió chớng. Nếu ở chỗ thờng xuyên có những luồng
gió (thí dụ gió mùa Đông Bắc ở miền Bắc, gió Lào ở Nghệ Tĩnh, Thanh Hóa),
lan sẽ chết rất nhanh. Nhng nếu ở nơi không khí tù hãm, ngột ngạt, lan cũng
không lớn và không trổ bông đợc.
ở bất cứ lứa tuổi nào, lan cũng cần đợc thoáng gió. Điều này cũng giải
thích là ở trong rừng ít khi ngời ta tìm thấy lan ở dới thấp (trừ địa lan ở xứ lạnh).
Lan thờng sống cheo leo trên các vách đá, hoặc bám chót vót trên các ngọn cây
cao. Độ thoáng gió là một trong những đặc tính quan trọng về sinh thái của cây
lan [10].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
10
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.2. Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nớc
2.2.1. Tình hình sản xuất hoa trên thế giới
Hiện nay sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và
đã trở thành một ngành thơng mại có lợi nhuận cao. Sản xuất hoa đã mang lại
lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nớc trồng và xuất khẩu hoa. Diện tích trồng
hoa trên thế giới ngày càng đợc mở rộng và không ngừng tăng lên. Năm 1989
tổng giá trị về hoa, cây cảnh thế giới đạt 1,8 tỷ đô la tới năm 1996 giá trị sản l-
ợng đạt 20 tỷ đô la trong đó Nhật 3,731 tỷ, Hà Lan 3,558 tỷ, Mỹ 3,720 tỷ (theo
trung tâm xuất khẩu của Liên hợp quốc ITC) [12].
Các nớc có ngành sản xuất và kinh doanh xuất khẩu hoa Lan đã và đang
chiếm lĩnh thị trờng là Thái Lan, Nhật Bản, Indoniaxia, Hà Lan, Hungary, Anh,
Bungary, Costarica, Đan Mạch, Bỉ, Italia, Pháp. Có nhiều tạp chí về hoa lan đợc
xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về hoa đợc tổ chức. Trớc đây việc nuôi trồng và
xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên gây nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng.
Ngày nay việc trồng lan đã trở thành quy mô công nghiệp, ngời ta xuất khẩu lan
đạt tới số lợng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao của thị trờng.
Các nớc Châu á với u thế về tự nhiên cũng đang phát triển mạnh mẽ

nghiên cứu khoa học, một phần sản xuất giống cung cấp cho thị trờng trong đó
có hoa lan. Ví dụ, Hải Phòng xây dựng khu nông nghiệp công nghệ cao (xã Mỹ
Đức, huyện An Lão) với mục tiêu cụ thể: Sản xuất 300.000 cây giống hoa lan
bằng công nghệ của Viện Công nghệ Sinh học - Trờng Đại học Nông nghiêp 1
và của Hiệp hội hoa lan Thái Lan (xây dựng khu nông- lâm nghiệp công nghệ
cao tại trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng năm 2003[7].
Một số nơi ở Việt Nam nh thành phố Hồ Chí Minh, Hà nội (có nhiệt độ
trung bình 23,5
0
C tổng lợng ma 1674 mm nhiệt độ tối cao 42,8
0
C. Tháng trung
bình lạnh nhất 13,7
0
C, biên độ nhiệt độ ngày 6,1
0
C) thích hợp phát triển các loài
lan nhiệt đới, Sapa (nằm ở độ cao 1570 m nhiệt độ trung bình 15,2
0
C lợng ma
2833mm rải đều trong năm. Nhiệt độ thấp nhất 5,9
0
C, cao nhất 29,8
0
C. Biên độ
nhiệt độ ngày đêm trung bình 6,2
0
C), Đà Lạt (nằm ở độ cao 1513 m, nhiệt độ
K9 Khoa Công nghệ sinh học
12

năng sinh sống và sinh sản hay không? Để trả lời câu hỏi này, nhiều nhà khoa
học đã tách tế bào ra khỏi cơ thể đa bào và nuôi trong môi trờng dinh dỡng nhân
tạo. Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào bắt đầu từ phơng pháp nuôi cấy tế bào này.
Hiện nay phơng pháp nhân giống này đã đợc áp dụng nhiều trên loại cây trồng
trong đó có hoa lan. Đây là phơng pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan
trên quy mô công nghiệp, các cây con đợc sản xuất hoàn toàn giống nhau từ
một cây bố, mẹ ban đầu [24, 25, 26, 27, 28].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
13
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.3.2. Một số nghiên cứu tiêu biểu
Geroges Morel(1956) đã nghiên cứu thành công phơng pháp nuôi cấy mô
tế bào của cây lan. Phơng pháp này để công bố trên tạp chí A. O. S (American
Orchid Society, 1960) và giống lan đầu tiên Morel áp dụng là Cymbidium. Năm
1963 Donol E. Vimbex cũng nghiên cứu thành công trên giống Cymbidium nh-
ng lại nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên môi trờng lỏng.
Năm 1996, Yonco Sagaw và T .Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô
phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai môi trờng lỏng và đặc. Nh
vậy, giống địa lan (Cymbidium) là nền tảng cho việc nhân giống bằng nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Khả năng ứng dụng rễ thấy nhất của phơng pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng.
Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một loài địa lan có rất ít hoặc không
có virus. Đồng thời ông cũng thành công trong kỹ thuật tạo protocorm, khi nuôi
cấy Meristem, các protocorm đợc cắt và nuôi cấy tiếp tục sẽ thu đợc các
protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây địa lan
con mới và là những cây sạch virus.
ở nớc ta, năm 1999 có Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Phùng Thị
Thanh Thuỷ, Lê Đức Thảo nghiên cứu về loài Hạc Đĩnh Nâu. Năm 2001 Phạm
Thị Liên đã nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan miền Bắc.
Hiện nay đã có nhiều Viện nghiên cứu, Sở Khoa học Công nghệ của nhiều tỉnh

năng hình thành chồi. ở Việt Nam, những nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế
bào hiện còn là vấn đề khá mới. Tới nay chỉ có một số kết quả nghiên cứu của
một số tác giả nh: Trần Thanh Vân, Bùi Thị ánh Tuyết, Trần Duy Quý, Lê Thị
ánh Hồng đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây
Saivitpaulia Vononvhawindhl. ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có
một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa
K9 Khoa Công nghệ sinh học
15
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.5. Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl)
2.5.1. Phơng pháp TCL kinh điển
Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986) thì lớp mỏng tế bào đợc
cắt theo chiều dọc hoặc chiều ngang từ những cơ quan khác nhau với kích cỡ rất
nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5mm) và số tế bào giảm đi cho phép TCL bộc lộ
tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai từ quá trình cài lồng gen. Cắt lớp
mỏng tế bào theo chiều dọc (itcl đợc sử dụng khi phân loại tế bào ( tế bào mô
rộng, biểu bì, tế bào tợng tầng, tế bào nhu mô) ITCL có thể cắt từ thân, gân lá,
cuống lá, lá mầm cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) cũng có thể sử
dụng cơ quan khác nh phiến lá, rễ, cơ quan của hoa thân, mô sinh đỉnh. Với
mục đích là để hình thành mô phân sinh đỉnh. Hình thành mô sẹo hoặc tái sinh
chồi. Cơ chất của môi trờng cấy thờng làm đặc hoặc lỏng. Một số loài thử
nghiệm thành công khi sử dụng TCL là cây thuốc lá, cà chua, lan hồ điệp. Dụng
cụ chứa là ống nghiệm hoặc đĩa peptri có kích thớc sao cho phù hợp với thể tích
môi trờng nuôi cấy và thể tích không khí để cung cấp dinh dỡng cho mẫu cấy.
2.5.2. Phơng pháp TCL cải tiến
Sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế để nghiên cứu động lực của các
con đờng sinh tổng hợp khác nhau và để làm giảm mức tối thiểu sự biến đổi nội
tạng của nhân tố môi trờng cũng nh tính gắn kết của vật liệu sinh học. Phơng
pháp cải tiến đợc Richard (1987) thực hiện bằng việc sử dụng các đĩa giếng
gồm 24 đĩa với kích thớc 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể

Bớc 2: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lợng thông qua con đờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Vấn đề này phải xác định đợc môi trờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp
để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trờng có nhiều
xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thờng là 25- 27
0
C và 16 giờ
chiếu sáng/ ngày, cờng độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại
đối tợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh suplơ cần
quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai
đoạn đầu cần che tối.
Bớc 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngời ta chuyển chồi từ môi trờng nhân nhanh sang
môi trờng tạo rễ thờng đợc bổ sung một lợng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát
K9 Khoa Công nghệ sinh học
17
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi
trờng không chứa chất điều tiết sinh trởng
Bớc 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đa cây từ ống nghiệm ra vờn ơm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trởng tốt
cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá,
số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nớc.
+ phải chủ động điều chỉnh đợc ẩm độ, sự chiếu sáng của vờn ơm cũng
nh có chế độ dinh dỡng phù hợp [17].
2.7. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro
2.7.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)

Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ
một số chất điều tiết sinh trởng và dinh dỡng cần thiết khác.
+ Bổ sung Poly Vinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt.
+ Sử dụng mô non gây vết thơng nhỏ nhất khi khử trùng.
+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và citric vài giờ trớc khi cấy.
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trờng lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 2 tuần).
+ Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trờng tơi trong 1 - 2 tuần.
2.7.4. Hiện tợng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity)
Trong quá trình nhân nhanh in - vitro thờng xuất hiện hiện tợng cây bị
thuỷ tinh hoá thân lá cây mọng nớc, trong suốt, cây rất khó sống khi đa ra
ngoài môi trờng do bị mất nớc rất mạnh. Hiện tợng này thờng xảy ra khi nuôi
cấy trong môi trờng lỏng hay môi trờng ít agar, sự trao đổi khí thấp. Cây bị thuỷ
tinh hoá thờng có hàm lợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân
cực nên dễ hấp thụ nớc. Cây in - vitro thờng có mật độ khí khổng cao, khí
khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi
cấy nên khi đa ra môi trờng tự nhiên dễ mất nớc.
Để khắc phục hiện tợng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp:
K9 Khoa Công nghệ sinh học
19
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
+ Giảm sự hút nớc của cây bằng cách tăng nồng độ đờng hoặc các chất gây áp
suất thẩm thấu cao.
+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trờng.
+ Giảm sự sản sinh etylen trong bình nuôi cấy.
+ Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trởng.
+ Tăng cờng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [17].
2.8. Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô
Tuy việc trồng lan trên thực tế không khó khăn lắm, nhng lan là một loài
hoa phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt trong đời sống của nó. Đối với
cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù là từ gieo hạt hay từ nuôi cấy mô, cho

kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung. Chất liệu trồng là ba phần vỏ
thông xay nhuyễn, với một phần cát, hoặc tám phần Osmunda (một chất liệu
nh rễ dớn của ta) xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn. Tất cả chất
liệu này đều đợc luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng.
Pha loãng dung dịch phân bón, một phần t muỗng cà phê phân bón với
một ga-lông (bằng 4,5 lít nớc) ngay tức khắc sau khi trồng phun vào cây. Đời
sống cộng đồng của chúng kéo dài một năm.
Water Richter (một nhà trồng lan nổi tiếng ngời Đức) trong cuốn
Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten thì viết nh sau: Để trồng cây từ
ống nghiệm ra ngời ta chuẩn bị chất nuôi cây gồm than bùn, than củi và cát với
tỉ lệ ngang nhau, hạt khá nhỏ, độ ẩm bình thờng. Đồ đựng là các chậu đất hoặc
đĩa, 1/3 phía dới ngời ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để
khoảng cách từ 2-3 cm.
Giai đoạn ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế
độ che sáng cũng khác nhau thờng tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây.
Đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con thì phải
đạt ở tiêu chuẩn sau đây:
- Giả banh và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nớc nh khi mới lấy
ở ống nghiệm ra.
- Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên
xanh đậm rất đẹp.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
21
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
- Khi trồng vào chậu cây con sống bình thờng nh cây lớn (tất nhiên phải
che nắng thích hợp, tránh cho cây bị nắng quá làm cháy lá và không để ma
to làm long gốc).
2.8.3. Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ
Sau khi cây trồng trong chậu chung ổn định một thời gian cần thiết phải
chuyển sang giai đoạn chậu nhỏ để cây phát triển tốt hơn. Giai đoạn này tùy

Có thể với một số cây Địa lan phát triển thành cụm lớn ta có thể chuyển
sang loại chậu to hơn nữa hoặc tách cụm thành những chậu bé hơn
2.9. Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản
2.9.1. Kĩ thuật trồng cây con vào chậu
Trớc khi trồng cần chuẩn bị:
+ Chậu đã đợc rửa sạch.
+ Giá thể phải đợc rửa sạch, khử trùng, chế biến theo công thức của từng ngời.
Nếu là các chất liệu nh than củi, vỏ cây, rễ cây dơng xỉ thì đợc chặt nhỏ kích th-
ớc khoảng 2-5 mm. Nếu là xơ dừa thì xé ra cho tơi và cắt thành đoạn khoảng
một đốt ngón tay. Xơ dừa đợc ngâm kĩ khoảng một tuần, rửa sạch rồi luộc kỹ và
sau đó rửa lại thật sạch nhiều lần cho hết chất chát. Sau đó phơi thật khô. Nên
chọn xơ dừa già vì xơ dừa già lâu mục.
Chọn những cục than to hoặc đá, mảnh sành kích thớc khoảng 2-3 cm,
đặt vào đáy chậu để giúp thoát nớc và thông thoáng bộ rễ, chiếm khoảng 1/3
dung tích. Sau đó đặt giá thể lên trên, khoảng 2 lớp mỏng rồi trồng cây con vào,
giữ cho cây đứng thẳng cho tiếp giá thể lên và chú ý đặt nhẹ nhàng cho rễ cây ở
hết bên dới giá thể và tránh làm gẫy và h hại rễ. Công việc này đòi hỏi làm phải
hết sức nhẹ nhàng và tỉ mỉ [12].
Khi cây mới đợc trồng vào chậu, lúc tới phải tránh làm lung lay, rễ vây
khó bám vào xơ dừa và than. Nếu trời ma quá to có thể làm cây long, nghiêng
ngả, đầu rễ bị h hại [20].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
23
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.9.2. Kỹ thuật chuyển chậu
Việc chuyển chậu cũng cần đợc chuẩn bị thật tốt nh khi trồng cây con
vào chậu nhỏ.
Về chậu: cần có kích thớc lớn ít nhất gấp 2,5 lần chậu con. Rửa sạch chậu.
Về giá thể: Đợc khử trùng là tốt nhất. Một số loại nh vỏ cây, vỏ dừa... kích thớc
cần lớn hơn khoảng 5-10 mm.

đã bốc hơi
hết. Trong tự nhiên nớc thông thờng có pH trong khoảng từ 4-9. Có ngời
khuyên dùng axit oxalic, axit nitric 10%, axit citric để tạo nớc có độ hơi axit
nếu nớc có pH cao (pH khoảng 5 là tốt nhất).
2.9.4. Kỹ thuật thúc mầm cây
Đợc thực hiện vào mùa xuân sẽ cho hiệu quả cao hơn nếu thực hiện vào
mùa thu. Chọn những cây khỏe mạnh để thúc mầm. Có thể thực hiện một trong
hai biện pháp sau:
- Biện pháp cơ giới: Tách nhánh ép mầm. Đây là biện pháp tách cụm để
thúc cho mầm mới phát sinh. Kết quả cho thấy khi tách 2 nhánh/cụm sẽ cho
hiệu quả tốt.
- Biện pháp hóa học. Đây là biện pháp sử dụng các chất kích thích nh
BAP thấm bông đắp lên giả hành hoặc chọc nhỏ thẳng vào đỉnh sinh trởng từ
3- 4 lần cách nhau tuần/lần. Aspirin, KH
2
PO
4
, H
3
BO
3
... với nồng độ 1/1000
tới cho cây khoảng cách 2 lần/tuần.
2.9.5. Phòng trừ bệnh cho cây
Trên thực tế, khi chúng ta trồng những cây lan con từ trong ống nghiệm ra
(bằng phơng pháp nuôi cấy mô thực vật) là chúng ta đã loại đợc những bệnh
nguy hiểm nhất cho lan là các bệnh do virus [15].
Bình thờng, nếu chúng ta dùng nớc sạch tới cho lan, và tạo cho các cây
lan con một môi trờng riêng biệt, sạch sẽ không có điều kiện cho lan con bị lây
chéo các bệnh khác của lan lớn hoặc cây khác thì lan con sống khỏe mạnh cho