i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐINH HUY SƠN
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG
KHỞI ĐỘNG CHO LÊN MEN PHO MÁT
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014
ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động
viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2014 Đinh Huy Sơn
iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luận văn này là kết quả nghiên cứu và làm việc của tôi, các
nội dung nghiên cứu kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, rõ ràng. Nếu có
bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2014
Tác giả luận văn Đinh Huy Sơn
1.1.4.3. Quá trình chuyển hóa citrate 11
1.1.4.4. Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 14
1.1.4.5. Quá trình phân giải protein 16
1.2. Giống khởi động cho sản xuất pho mát 19
1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát
19
1.2.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 20
1.2.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 21
1.2.1.3. Các chủng khởi động “thủ công” 22
1.2.2. Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp 23
1.2.2.1. Sản xuất axit 23
1.2.2.2. Tổng hợp enzym phân giải protein 23
1.2.2.3. Tổng hợp exopolysaccharide 24
vi

1.2.2.4. Khả năng tạo hương 25
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt
Nam 26
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27
2.1. Hóa chất và thiết bị 27
2.1.1. Hóa chất 27
2.1.2. Thiết bị 27
2.2. Nguồn sữa và chủng vi sinh vật 28
2.3. Môi trường 28
2.2.1. Môi trường MRS 28
2.2.2. Môi trường thử citrate 28
2.2.4. Môi trường thử khả năng đông tụ sữa 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu 29
2.4.1. Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa 29
2.4.2. Phương pháp xác định kiểu len men 30

3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đường 55
3.2.3. Phổ hoạt tính enzym 58
3.3. Phối trộn 2 chủng M11 và T21 60
3.3.1. Thời gian đông tụ và đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng M11
và T21 60
3.3.2. Khả năng tạo các hợp chất dễ bay hơi của hỗn hợp chủng M11 và T21
trong lên men sữa 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 73
viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm 3
Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát
Cheddar (ủ chín 6 tháng) 16
Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua
axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase 19
Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát 19
Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL 36
Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM 37
Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát 42
Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic 44
Bảng 3.3: Dải nhiệt độ sinh trưởng của các vi khuẩn lactic 46
Bảng 3.4: Kiểu lên men lactic của các vi khuẩn lactic 47
Bảng 3.5: Khả năng chuyển hóa citrate của các vi khuẩn lactic 48

Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm
sữa lên men 18
Hình 1.10: Vị trí của polysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn Gram (+) và
Gram (-) trên tế bào 25
Hình 3.1: Khả năng đông tụ sữa của VNC1 và T21 sau 24 giờ 45
Hình 3.2: Khả năng sử dụng citrate 48
Hình 3.3: Hoạt tính phân giải casein của các vi khuẩn lactic 51
Hình 3.4 : Hình thái tế bào hai chủng T21 và M11 54
Hình 3.5: Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng M11 và T21 sau 48h 57
Hình 3.6: Hoạt tính enzym dịch nội bào của chủng M11 và T21 60 x

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin
CoA Coenzyme A
CO
2
Carbon dioxide
CPS Capsular polysaccharides
DNA Deoxyribonucleic Acid
DPPH 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl

pho mát chỉ đạt 24,04 triệu USD (năm 2008), chiếm khoảng 7% tổng kim ngạch
nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa. Một trong những nguyên nhân là do sản
phẩm chưa hợp với thị hiếu của người Việt Nam và giá thành cao. Tuy nhiên, cùng
với đà tăng trưởng kinh tế thì nhu cầu về các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, tốt
cho sức khỏe như pho mát sẽ tăng cao. Năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản
phẩm từ sữa bình quân đầu người đang ở mức rất thấp 11,2 kg/người/năm so với
mức bình quân 62 kg/người/năm của Châu Á, 96 kg/người/năm của thế giới và 248
kg/người/năm ở các nước phát triển. Như vậy có thể thấy nhu cầu về sữa và các sản
phẩm từ sữa trong đó có pho mát ở Việt Nam còn rất lớn.
Vi khuẩn lactic được coi là vi sinh vật an toàn và đã được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm. Trong ngành công nghiệp sản
xuất pho mát, các vi khuẩn lactic với vai trò là giống khởi động được sử dụng nhằm
tạo lập các đặc điểm đặc trưng về cảm quan, cấu trúc và dinh dưỡng cho sản phẩm.
Hơn nữa, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng góp phần tích cực chuyển hóa các sản
phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các giống
khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một, hai hoặc một vài
chủng thuộc thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc.
2

Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm
giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua. Tuy
nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho mát vẫn chưa
được tiến hành nhiều. Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát”.
Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi
động phục vụ cho sản xuất pho mát.
Nội dụng nghiên cứu
 Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn lactic làm giống khởi động trong
sản xuất pho mát: khả năng đông tụ sữa, kiểu hình lên men lactic, sinh
tổng hợp exopolysaccharide, chuyển hóa citrate, hoạt tính X – prolyl –

Độ ẩm, % Sản phẩm
Pho mát mềm 55- 80
Pho mát tươi, không ủ chín: Cottage, Ricotta,
Quarg, Mozzarella
Pho mát ủ chín bề mặt bằng nấm mốc: Brie,
Camembert
Pho mát bán
rắn
41 - 55
Pho mát có quá trình ủ chín: Limburger,
Gorgonzola, Roquefort
Pho mát rắn 20 - 40
Pho mát ủ chín có cấu trúc mắt: Emmental
Pho mát ủ chín không có cấu trúc mắt: Cheddar,
Cheshire
4

Phân loại pho mát dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất:
- Pho mát tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung enzym rennet hoặc nếu có thì
với tỷ lệ rất thấp. Axit được tạo ra thường bằng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên có một
số loại pho mát tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta – lactone. Sản phẩm
điển hình là Cottage, Quark, Cream và pho mát tươi Bắc Mỹ.
- Pho mát tươi đông tụ bởi rennet, không bổ sung vi khuẩn lactic hoặc nếu có
thì rất ít như: Quesco, Balnco, Quesco Fresco, Halloumi, pho mát tươi từ Ý.
- Pho mát đông tụ bởi axit ở nhiệt độ cao. Sản phẩm có độ ẩm cao nhưng chắc.
Sản phẩm điển hình như Ricotta (Ý), Channa và Paneer (Ấn Độ), pho mát trắng
Mỹ - Latin.
- Pho mát mềm ủ chín: vi khuẩn lactic được cấy vào để lên men lactic trước khâu
được đông tụ bởi enzym rennet. Một số pho mát điển hình như: Fetta, Camembert,
Brie, Blue.

Mozzarella, Edam đã được nhập khẩu vào Việt Nam nhưng mức tiêu thụ chưa cao.
Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng các sản phẩm sạch và có giá trị dinh dưỡng cao ngày
Triệu tấn
6

càng tăng nên các sản phẩm như pho mát sẽ có nhiều triển vọng. Năm 2008, kim
ngạch nhập khẩu pho mát đạt 24,04 triệu USD, tăng 7,33 triệu USD so với năm
2007. Năm 2009, kim ngạch nhập khẩu pho mát 11 tháng đầu năm chiếm 7,23%
tổng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa [6]. Đến nay, pho mát đã trở
thành loại thực phẩm khá quen thuộc ở các thành phố lớn. Đánh giá được nhu cầu
về pho mát sẽ tăng trưởng ở Việt Nam, đặc biệt là loại pho mát chế biến hợp với
khẩu vị và sở thích của người Việt Nam, các công ty chế biến sữa quy mô vừa và
nhỏ như công ty Cổ phần Sữa Ba Vì đang chuẩn bị tham gia vào lĩnh vực sản xuất
này.

Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa
của Việt Nam, năm 2009 [6]
1.1.3. Công nghệ sản xuất pho mát
Sản xuất pho mát thực chất là quá trình loại nước khỏi sữa, trong đó casein và
chất béo của sữa được cô đặc từ 6 – 12 lần tùy từng loại pho mát, bắt đầu bằng một
hoặc kết hợp của hai quá trình: lên men nhờ vi sinh vật và đông tụ protein sữa nhờ
enzym rennet. Quy trình sản xuất pho mát gồm các khâu chính: đông tụ sữa, loại
nước khỏi quện sữa (cắt quện sữa, nấu, khuấy, ép), tạo hình (nghiền, đổ khuôn, ép)
và muối. Tuy nhiên, ở mỗi khâu cách thức thực hiện khác nhau đã tạo ra các sản
phẩm đặc trưng riêng. Quy trình sản xuất có thể tóm tắt như sau [9, 10, 59]:
7

- Tiêu chuẩn hóa: Pho mát có thể làm từ sữa, sữa đã tách béo hoặc tách một
phần chất béo. Trước khi đưa vào sản xuất sữa được tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo
nguồn nguyên liệu ổn định để tạo ra sản phẩm pho mát có chất lượng đồng nhất.

độ ủ chín thường 4 – 12
o
C, tùy từng pho mát mà thời gian ủ chín có thể từ 1 – 2 tháng
(Emmental), 2 – 3 tháng (Gouda) hoặc tới 2 năm (Parmigiano – Reggiano).
8 Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) [59]
1.1.4. Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát
Quá trình sản xuất pho mát đòi hỏi phải có vi khuẩn lactic (LAB). Chúng có
thể được chủ động bổ sung vào sữa hoặc sử dụng ngay những vi khuẩn có mặt trong
sữa tươi.
Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trên toàn thế giới, đóng vai trò quan trọng
trong lên men thực phẩm ở quy mô công nghiệp. Thuật ngữ vi khuẩn lactic dùng để
chỉ đặc điểm của quá trình trao đổi chất cơ bản của nhóm vi khuẩn này: Chuyển hóa
đường hexose chủ yếu thành axit lactic. Do liên quan tới sản xuất axit lactic nên
9

định nghĩa mang tính chất hóa sinh nhiều hơn phân loại học. Trong sản xuất pho
mát, các vi khuẩn lactic tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa:
1.1.4.1. Quá trình chuyển hóa lactose
Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng giống
khởi động trong sản xuất pho mát. Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh hưởng đến cấu
trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng pho mát do pH quyết
định khả năng hòa tan của casein [61]. Ngoài ra, pH còn gián tiếp tác động tới việc
tổng hợp chất thơm: tạo ra hệ đệm quy định sự sinh trưởng của vi sinh vật và khả
năng hoạt động của các enzym trong quá trình ủ chín.
Tùy theo giống khởi động mà lactose có thể được chuyển hóa theo con đường
Embden-Meyerhof (EM) hoặc con đường phosphoketolase (hình 1.4). Theo con đường
EM, từ một phân tử glucose tạo ra hai phân tử axit lactic. Theo con đường

oxy hóa lactate xảy ra rất hạn chế do lượng oxy sẵn có thấp [61].

Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát [59,61]
1) Sự raxemic hóa; 2) Chuyển hóa bởi Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy
Sĩ; 3) Quá trình oxi hóa lactate; 4) Chuyển hóa thành formate, ethanol và acetate; 5)
Chuyển hóa kị khí lactate thành butyrate và H
2
.
11

Ở một số loại pho mát rắn, quá trình đường phân có thể tạo ra một số sản
phẩm không mong muốn trong giai đoạn ủ chín. Dưới điều kiện kị khí, Clostridium
tyrobutyricum chuyển hóa lactate thành butyrate và khí H
2
. Quá trình này không chỉ
tạo ra khí H
2
gây hiện tượng vỡ pho mát mà còn liên quan đến sự phát triển của các
hợp chất không có hương vị [61]. Để tránh hiện tượng này, một số kỹ thuật làm
giảm số lượng bào tử trong sữa được sử dụng như: vệ sinh sạch sẽ, ngăn cản sự nảy
mầm của bào tử bằng việc bổ sung lysozyme hay bổ sung thêm nitrate (NO
3
-
) hoặc
loại bỏ cơ học các bào từ bằng vi lọc [59].
1.1.4.3. Quá trình chuyển hóa citrate
Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94% trong số
này bị mất trong quá trình sản xuất pho mát do hòa tan vào huyết tương sữa [60].
Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong quện sữa (10mmol/kg quện sữa) lại
đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp chất thơm bay hơi. Một số

diacetyl synthase chưa được nhận dạng một cách rõ ràng ở LAB hoặc có thể được
tổng hợp từ quá trình oxy hóa α – acetolactate [56]. Diacetyl thường được tổng hợp
với một lượng rất nhỏ (<0,11 mmol) trong khi đó lượng acetoin sinh ra cao hơn 10
– 50 lần [59].
Một số loài Lactobacillus có khả năng sử dụng citrate để tổng hợp succinate
(hình 1.7). Succinate là một axit hữu cơ, có vị cay mặn, là một trong 15 hợp chất cần
thiết tạo nên hương vị của pho mát. Ở pho mát Emmental, hàm lượng succinate được
công bố là 0,8 – 1,4 g/kg [25]. Ở pho mát Cheddar, một số loài Lactobacillus tổng
hợp succinate thông qua chu trình tricacboxilic acid dạng rút gọn (chu trình TCA)
[42]. Ở pho mát Thụy Sĩ, succinate được các vi khuẩn propionic tổng hợp từ quá trình
dị hóa axit aspartic. Các chủng này không phải đóng vai trò là chủng khởi động.

Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus [25]
Các enzym tham gia: 1 – lactate dehydrogenase; 2 – pyruvate casrboxylase; 3 –
malate dehydrogenase; 4 – fumarase; 5 – fumarate reductase; 6 – citrate lyase; 7 –
aspartate aminotransferase; 8 – aspartase; 9 – aconitase; 10 – isocitrate lyase
14

1.1.4.4. Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo
Chất béo sữa có vai trò quan trọng để tạo nên những hợp chất hương thuần túy
của pho mát. Những nghiên cứu ở pho mát Cheddar cho thấy pho mát được sản xuất
từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính
xác. Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất
loại pho mát ít hoặc tách chất béo [29, 60].
Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín pho mát.
Lipase tồn tại trong pho mát do nhiều nguồn khác nhau. Bản thân sữa tươi cũng
chứa enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh
trùng. Một số pho mát Ý như Provolone, Pecorino trong quá trình sản xuất người ta
bổ sung hỗn hợp lipase, esterase cùng với enzym rennet. Hệ enzym lipase/esterase
của chủng khởi động ít được quan tâm hơn hệ enzym phân giải protein. Các loài