BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ QUYÊN ðÁNH GIÁ ðỘ THUẦN, KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ,
ðẠO ÔN, RẦY NÂU VÀ CHẤT LƯỢNG CÁC DÒNG G2 BỐN GIỐNG
LÚA NẾP ðÈO ðÀNG, LÚA TẺ KHẨU DAO, BLE CHÂU VÀ PUDE
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 06.42.02.01
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
báu và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận văn này.
ðể hoàn thành khoá học này, tôi còn nhận ñược sự ñộng viên hỗ trợ rất lớn
của gia ñình, bạn bè ñã tạo ñiều kiện về vật chất và tinh thần ñể tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
TÁC GIẢ Nguyễn Thị Quyên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
iii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan…………………………………………………………………… i
Lời cảm ơn………………………………………………………………………ii
Mục lục………………………………………………………………………….iii
Danh mục bảng.…………………………………………………………………vi
Danh mục hình…………………………………………………………………vii
Danh mục viết tắt…………………………………………………………… viii
Phần I. MỞ ðẦU 1
1.1. ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu 2
1.2.1 Mục ñích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
3.2.3. Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá, ñạo ôn, rầy nâu các dòng G2 của 4
giống lúa bằng PCR 32
3.2.4. ðánh giá chất lượng của 4 giống lúa 36
3.3. Phương pháp xử lý số liệu 39
Phần IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41
4.1. Một số ñặc ñiểm hình thái bốn giống lúa 41
4.2. Kết quả ñánh giá ñộ thuần qua theo dõi một số tính trạng nông sinh học 42
4.2.1. Kết quả ñánh giá các dòng của giống nếp ðèo ñàng 42
4.1.2. Kết quả ñánh giá các dòng của giống tẻ Pude 42
4.1.3. Kết quả ñánh giá các dòng của giống tẻ Ble châu 43
4.1.4. Kết quả ñánh giá các dòng của giống tẻ Khẩu dao 43
4.3. Kết quả ñánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá, ñạo ôn và rầy nâu 45
4.3.1. Kết quả ñánh giá khả năng kháng bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 46
4.3.2. Kết quả chạy PCR kiểm tra gen kháng bạc lá, ñạo ôn và rầy nâu 48
4.4. ðánh giá các chỉ tiêu về chất lượng gạo 56
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
v
4.4.1. Tỷ lệ gạo lật, gạo xát 56
4.4.2. Chiều dài, chiều rộng và dạng hình gạo xay 57
4.4.3. Dạng nội nhũ và ñộ bạc bụng 58
4.4.4. Hàm lượng amylose 59
4.4.5. Nhiệt ñộ hóa hồ 60
4.3.6. ðánh giá cảm quan mùi thơm 60
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62
5.1. Kết luận 62
5.2. Kiến nghị 63
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
vii
DANH MỤC HÌNH
STT TÊN HÌNH TRANG
1 Bông, hạt thóc và gạo lật giống nếp ðèo ñàng và tẻ Ble châu 41
2 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR gen Xa4. M: Marker 1kb 50
3 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR gen Xa7. M: Marker 1kb 50
4 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Pi-ta. M: Marker 1kb 52
5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Bph4. M:
Marker 1kb 52
6 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Bph10. M: Marker 1kb 53
7 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme HinF1 phát
hiện gen kháng Bph10. M: Marker 1kb. 53
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
ixHọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
1
Phần I. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, ñược
trồng phổ biến ở 112 nước. Lúa là nguồn cung cấp lương thực cho hơn 50% dân
số thế giới và là lương thực chính cho phần lớn các quốc gia ở Châu Á, một số
nước ở Châu Phi và Mỹ La tinh (Chang, 2000). Ở Việt Nam, cây lúa là cây
trồng bản ñịa có khả năng thích nghi rộng với các ñiều kiện sinh thái khác nhau.
Lúa vừa cung cấp nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim
ngạch lớn ở nước ta (Trần Văn ðạt, 2008). Năng suất và sản lượng lúa của nước
ta không ngừng tăng lên, năm 1990 năng suất lúa ñạt 31,8 tạ/ha; năm 2000: 42,4
tạ/ha; năm 2010: 53 tạ/ha. Sản lượng lúa năm 1990 là 19,2 triệu tấn; năm 2000:
32,5 triệu tấn và năm 2010: 39,9 triệu tấn (Bui Ba Bong, 2010).
ðể ñạt ñược những thành quả trên công tác chọn tạo giống ñóng một vai
trò quan trọng. Một trong những mục tiêu chọn tạo giống lúa hiện nay là tạo ra
các giống lúa vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu ñược nhiều loại
sâu, bệnh hại. Bên cạnh việc tạo các giống lúa mới, công tác bảo tồn, khôi phục
nguồn gen các giống lúa ñịa phương ñang là một yêu cầu cấp thiết. ðây là
nguồn vật liệu khởi ñầu quan trọng ñể các nhà chọn giống tiến hành lai tạo
giống. Việt Nam có ñiều kiện ñịa hình, khí hậu ña dạng, phong phú cùng với sự
ña dạng thành phần các dân tộc nên tài nguyên di truyền lúa thuộc vào loại
phong phú trên thế giới (Chang, 1976). Tập ñoàn các mẫu giống lúa ñịa phương
Khẩu dao, Ble châu, Pude.
- ðánh giá chất lượng, khả năng kháng bệnh bạc lá, ñạo ôn và rầy nâu của
4 giống ðèo ñàng, Khẩu dao, Ble châu, Pude.
1.2.2 Yêu cầu
+ Khảo sát, ñánh giá ñộ thuần của các dòng G2 chọn lọc từ 4 giống lúa:
ðèo ñàng, Khẩu dao, Ble châu, Pude.
+ Tiến hành ñánh giá nhân tạo bệnh bạc lá của 4 giống lúa bằng cách lây
nhiễm với nguồn bệnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
3
+ Xác ñịnh gen kháng bệnh bạc lá, ñạo ôn và kháng rầy nâu bằng chỉ thị
phân tử.
+ ðánh giá các chỉ tiêu về chất lượng.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần hoàn thiện qui trình phục tráng
bốn giống lúa Nếp ðèo ñàng, Khẩu dao, Ble châu, Pude.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
- ðánh giá ñộ thuần nhằm chọn lọc ñược các dòng G2 chuẩn, ñúng giống
ñể tiến hành hỗn các dòng, thu ñược các hạt giống lúa siêu nguyên chủng của bốn
giống lúa.
- Việc khảo sát nguồn gen kháng bạc lá, ñạo ôn, rầy nâu và ñánh giá chất
lượng bốn giống lúa nghiên cứu là nền tảng cho việc chọn vật liệu khởi ñầu
trong công tác lai tạo giống và việc ñưa các gen quan trọng vào các giống lúa. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
5
sinh học tốt, năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh và ñiều kiện
ngoại cảnh bất thuận như hạn, úng, chua, mặn, phèn (Nguyễn Văn Hiển, 2000).
2.1.2. Nguồn gen lúa trồng Việt Nam
Nguồn gen cây lúa Việt Nam thuộc dạng phong phú. Công việc thu thập
và bảo tồn nguồn gen cây lúa ở nước ta ñã ñược bắt ñầu từ những năm 1977.
ðến nay Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật ñã thu thập và hiện ñang bảo
tồn trên 5000 mẫu giống, Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñang bảo tồn hơn
1800 mẫu giống (Nguyễn Văn Luật, 2009).
Lê Thị Dự (2000) phân tích ña dạng di truyền vật liệu khởi ñầu cho thấy
47 giống lúa ñịa phương và cải tiến có sự ña dạng di truyền cao và ñược phân
thành năm nhóm theo khoảng cách di truyền. Nguyễn Thị Quỳnh (2004) nghiên
cứu ñánh giá ña dạng của 711 giống lúa ñịa phương thu thập tại 17 tỉnh thuộc
các vùng sinh thái nông nghiệp Tây Bắc, ðông Bắc và ñồng bằng sông Hồng.
Kết quả trong thành phần của tập ñoàn có 81,8% giống thuộc loại hình japonica,
18,2% giống thuộc loại hình indica. Trần Danh Sửu (2008) ñã ñánh giá ña dạng
di truyền của lúa tám ñặc sản Việt Nam kết quả phát hiện 36,6% mẫu giống
thuộc loài phụ japonica, trong ñó có 20/21 giống có mùi thơm là nguồn tài
nguyên cực kì quý hiếm trên thế giới. ðánh giá ña dạng di truyền các nguồn vật
liệu mẫu giống lúa ñịa phương, nhập nội và giống cải tiến, thiết lập mối quan hệ
giữa chúng dựa vào ñặc ñiểm hình thái và nông học là mục ñích của nghiên cứu
này phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa thuần có năng suất và chất lượng.
2.1.3. Các hướng sử dụng nguồn gen ñịa phương
Các giống ñịa phương ñược hình thành do quá trình chọn lọc tự nhiên và
nhân tạo lâu dài trong ñiều kiện ñịa phương. Các ñặc ñiểm cơ bản của giống và
quần thể ñịa phương là: Cho năng suất ổn ñịnh do thích nghi cao với ñiều kiện
ñịa phương; có tính chống chịu cao với một số loài sâu bệnh nguy hiểm và ñiều
kiện ngoại cảnh bất thuận; là một quần thể phức tạp bao gồm nhiều dạng trong
ñó dạng chính chiếm ưu thế, tất cả các dạng này ñảm bảo cho giống ñịa phương
ðèo ñàng là giống lúa nếp ñặc sản ñịa phương ñược trồng trên nương từ tháng 6
– 7, thu hoạch vào tháng 10 -11, chịu hạn tốt, chiều cao cây trung bình, chống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
7
ñổ tốt, ñẻ ít, bông to > 200 hạt, cây cứng, lá khá rộng và dài. Hạt gạo trong, hơi
bầu và bóng, tỷ lệ gạo nguyên cao, cơm thơm và dẻo rất lâu. Giống này có khả
năng kháng ñược bệnh bạc lá, ñạo ôn và rầy nâu tốt. Tuy nhiên, nguồn hạt giống
của giống này do không ñược làm thuần nên tỷ lệ phân ly, hạt lẫn tạp (khác màu,
khác dạng, khác chất lượng ) cao, vì thế chất lượng của giống lúa này không ổn
ñịnh, năng suất suy giảm nghiêm trọng và diện tích gieo trồng cũng ngày càng
thu hẹp lại, rất cần phải ñược phục tráng phát triển lại giống lúa nếp chất lượng
cao này.
Giống lúa Pude là giống lúa tẻ nương hiện ñược gieo trồng nhiều ở các xã
Phình Sáng, Ka Ma, Mường Chung, Mường Mùn, Tỏa Tình và Kênh Phong của
huyện Tuần Giáo, tỉnh ðiện Biên. Giống lúa Pude ñược các bà con dân tộc trồng
trên nhiều loại ñất khác nhau, hiện diện tích gieo cấy toàn huyện khoảng 50 - 60
ha. Giống có khả năng chịu hạn tốt, kháng ñược bệnh bạc lá, ñạo ôn và sâu
bệnh, khả năng ñẻ nhánh trung bình, thâm canh cao có thể bị ñổ, năng suất có
thể ñạt 2,5 – 3,0 tấn/ha. Thời vụ gieo trồng từ tháng 4 thu hoạch vào cuối tháng
10. Giống có dạng hạt hơi bầu, gạo trong không bạc bụng, cơm thơm dẻo, nấu
ñể từ 10 – 12 giờ vẫn còn dẻo, hàm lượng amylose khoảng 16 – 18%. ðây là
giống lúa ñặc sản ñịa phương của huyện Tuần Giáo tỉnh ðiện Biên. Tuy nhiên
giống bị lẫn tạp và thoái hóa mạnh, năng suất và chất lượng không ổn ñịnh nên
rất cần ñược phục tráng lại.
Giống Ble châu ở Sơn La là giống lúa nương ñặc sản ñịa phương tỉnh
Sơn La, hiện ñang ñược gieo trồng ở nhiều nơi thuộc huyện Mộc Châu, Thuận
Châu và Sông Mã, vùng có người H’Mông sinh sống, với diện tích mỗi huyện
ước khoảng 10 – 30 ha. Giống có ñặc ñiểm hạt nhỏ, thon dài, màu trắng sáng,
+ Lẫn tạp cơ giới: do quản lý kém từ gieo hạt ñến thu hoạch, chế biến,
bảo quản và vận chuyển hạt giống. ðây là nguyên nhân nguy hiểm dẫn ñến suy
giảm ñộ thuần một cách nghiêm trọng, ñặc biệt khi hệ số nhân của giống lẫn cao
hơn hệ số nhân của giống cơ bản.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
9
+ Lẫn tạp sinh học: do ñiều kiện cách ly không ñảm bảo, giống cơ bản nhận
phấn của các giống khác loài trong khu vực sản xuất dẫn ñến phân ly tạo cá thể
khác dạng ở lần nhân tiếp theo.Lẫn sinh học xảy ra cả với cây tự thụ phấn và cây
giao phấn, nhưng cây giao phấn xảy ra thoái hóa nhanh và nghiêm trọng hơn.
+ Lẫn tạp do hiện tượng phân ly: Những giống cây trồng, dòng bố mẹ
ñược tạo ra từ các nguồn vật liệu biến dị bằng lai, ñột biến…nhưng không thể
chọn ñồng hợp tử trên tất cả các cặp gen, hoặc ngay bản thân chúng còn tồn tại
các cặp gen dị hợp. Trong quá trình gieo trồng các cặp gen dị hợp ñó sẽ phân ly
tạo ra cá thể khác dạng.
+ Lẫn tạp từ ñột biến tự nhiên: Cây trồng trên ñồng ruộng chịu tác ñộng
của các yếu tố môi trường: khí hậu, ñất ñai, tia bức xạ,…những thay ñổi ñó dẫn
ñến ñột biến tự nhiên.
+ Tích lũy bệnh: Tích lũy bệnh là nguyên nhân thoái hóa giống, ñặc biệt
bệnh virus. Sản xuất giống một loài cây trồng trên một khu ñất trong nhiều vụ,
nhiều năm dẫn ñến tăng mức ñộ bệnh gây ra thoái hóa giống
+ Kỹ thuật sản xuất không phù hợp: ñiều kiện sản xuất không phù hợp gây
thoái hóa giống thông qua chất lượng hạt giống kém, thay ñổi di truyền hay
nhiễm bệnh.
Biện pháp khắc phục
+ Có khu sản xuất giống riêng
+ Vệ sinh dụng cụ, máy móc, ñồng ruộng, sân phơi, nhà kho và dụng cụ
chứa trước khi sản xuất
khác biệt lớn, nhưng những ñặc ñiểm có sự sai khác ít hơn thì ñộ chính xác sẽ
kém. Xác ñịnh cây ở giai ñoạn còn non với một lượng lớn các ñặc ñiểm khác
nhau sẽ xác ñịnh ñược ít loài hơn. Các phương pháp ñánh giá dựa trên vật hậu,
hình thái này ñều bị ảnh hưởng bởi môi trường, việc nhân rộng các quan sát thực
ñịa là tốn kém, tốn thời gian, không chính xác. Hình thái học không thể cung cấp
thông tin về ñộ tinh khiết của các thuộc tính di truyền cụ thể liên quan ñến chất
lượng ngũ cốc hoặc sâu bệnh hoặc kháng thuốc diệt cỏ… Phương pháp sinh hóa,
ñiện di protein, hoặc nghiên cứu ñánh dấu isozym cũng bị ảnh hưởng bởi môi
trường và tiết lộ ña hình thấp. Khảo nghiệm mùa vụ là một phương pháp xác
ñịnh ñộ thuần ñáng tin cậy, nhưng phương pháp này ñòi hỏi một mùa sinh
trưởng, phát triển, ñòi hỏi thời gian dài, tốn kém, và cách xác ñịnh này bị ảnh
hưởng bởi yếu tố con người, khí hậu dẫn ñến kết quả không chính xác. ðể khắc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
12
phục những hạn chế ñó, người ta ñưa ra những phương pháp mới. ðặc biệt sự
phát triển của công nghệ sinh học ñã ñưa ñến những thành công trong việc sử
dụng chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ñộ thuần của hạt giống (Xianzheng, 2006).
2.2.4. Các chỉ thị phân tử ñược ứng dụng trong xác ñịnh ñộ thuần
Theo Phan Hữu Tôn, 2005:
a. Lai DNA/DNA (Phương pháp RFLP ña hình các ñoạn cắt giới hạn):
Dùng các enzyme cắt giới hạn (RE: restriction enzym) cắt các trình tự gen
thành các ñoạn ngắn, ñiện di sản phẩm và phát hiện bằng các mẫu dò ñặc hiệu
ñể nhận dạng gen.
b. ALP (Amplicon length polymorphism):
Sự ña hình chiều dài những ñoạn DNA ñược nhân bản trên cơ sở phương
pháp PCR.
c. AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism):
ðược Vos và cộng sự ñề xuất năm 1995. Phương pháp này tiến hành trên
cơ sở kết hợp của phương pháp RFLP và RAPD. ðầu tiên người ta dùng enzym
* Tương lai áp dụng chỉ thị PCR trong chọn tạo giống lúa
Sự phát triển nhanh chóng của kĩ thuật chỉ thị ADN ñã cho phép các nhà
khoa học có cơ hội sử dụng những phương tiện mới thay thế phương pháp cũ
trong chọn giống cây trồng. Ưu việt cơ bản của phương pháp chọn lọc chỉ thị
phân tử là rút ngắn thời gian tạo giống và giảm giá thành trong việc chọn lọc
những tính trạng mà khó có thể ñánh giá ñược trong ñiều kiện truyền thống. Do
vậy chọn lọc chỉ thị phân tử cho phép tăng hiệu quả của chọn lọc, qui tụ ñược
nhiều gen nhằm tăng khả năng chống bệnh cho lúa góp phần vào việc tăng sản
lượng lúa.
Tuy nhiên vẫn còn 3 trở ngại cần ñược khắc phục ñể sử dụng có hiệu quả
phương pháp này.
+ Thứ nhất là hiện nay tốc ñộ nghiên cứu về ñịnh vị gen còn rất chậm ñã làm
hạn chế vốn gen có thể dùng phương pháp này. Thêm vào nữa rất nhiều gen chọn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
14
lọc còn nằm khá xa các chỉ thị phân tử ñã ñược nghiên cứu, do vậy không thể sử
dụng ñược. Vấn ñề này không chỉ xẩy ra ñối với lúa mà còn ñối với cây trồng khác,
cần phải phát triển kĩ thuật mới nhằm ñịnh vị nhanh và nhiều gen hơn.
+ Trở ngại thứ hai là số lượng có hạn các chỉ thị PCR ñược ứng dụng
trong chọn lọc chỉ thị phân tử. Mặc dầu có nhiều gen ñã ñược ñịnh vị với RFLP
hoặc các chỉ thị khác nhưng ít chỉ thị có thể dùng chuyển sang phương pháp
PCR, bởi vì có trường hợp sự ña hình của sản phẩm PCR bị biến mất khi RFLP
hoặc chỉ thị phân tử khác ñược chuyển ñổi thành phương pháp PCR chỉ thị phân
tử. ðể khắc phục vấn ñề này, việc ñiều tra có hệ thống nhiều nguồn gen lúa về
sự ña hình của chúng trên cơ sở phương pháp chỉ thị PCR là rất cần thiết. Kết
quả ñiều tra sẽ cung cấp số liệu cơ sở từ ñó nhà chọn giống có thể chọn những
chỉ thị nào có thể chuyển sang PCR cho kết quả một cách ñáng tin cậy.
+ Trở ngại thứ 3 là giá thành của phương pháp chỉ thị phân tử còn khá
cao, giá này thay ñổi tuỳ theo tính trạng, giá này còn phụ thuộc vào từng nước.
2009). Từ các kết quả nghiên cứu trong nước, bước ñầu có thể khẳng ñịnh các
gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt
trên các giống lúa ñịa phương ở Việt Nam. Trong ñó, các gen kháng Xa4, xa5 và
Xa7, là các gen kháng hữu hiệu với các chủng ở Việt Nam, các gen này có nghĩa
quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh (Phan Hữu Tôn và Bùi
Trọng Thủy, 2004).
Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng bệnh ñã ñược xác
ñịnh như: chỉ thị RZ390, RG556 và RG207 liên kết với gen xa5, gen Xa21 ñược
xác ñịnh thuộc nhiễm sắc thể (NST) số 11 và liên kết chặt với chỉ thị pTA248
(Ronald và cs., 1992)… Với các phát hiện trên, nhiều nhà chọn tạo giống trên
thế giới ñã sử dụng marker phân tử ñể phát hiện ra các gen quan tâm. Luo Yan-
chang và cs. (2004) sử dụng chỉ thị pTA248 và RM248 xác ñịnh gen Xa21,
Siriporn Korinsak và cs. (2009) sử dụng chỉ thị SSR (RM30, RM7243, RM5509,
RM400) ñể phát hiện gen kháng bệnh bạc lá.
Copyright: Tài liệu đại học ©