THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ
CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
GV: ThS. Hoàng Minh Hảo
KS. Nguyễn Bình Kha

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia
TP. HCM.
[2]. Nguyễn Khác Quỳnh Cứ (1999), Bài giảng chiết xuất dược liệu. Bộ môn dược liệu.
ĐH Y-Dược TP. Hồ Chí Minh, 45-97.
ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
 Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được
cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây
cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất
phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên
cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn
bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa
tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng.
 Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ
phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan
nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có
tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung
môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực.
phân cực khác nhau.
 Pha động: Dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm
lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó.
III. Cách tiến hành
1. Các bước chuẩn bị trước khi SKLM
1.1 Chuẩn bị vi quản
Dụng cụ
 Ống vi quản
 Đèn cồn
 Kẹp
 Lọ thủy tinh
 Giấy thấm
 Aceton

Cách tiến hành
Dùng 2 tay cầm 2 đầu ống vi quản, hơ nóng đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo.
Đem vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu ống ra xa. Giữ yên cho đến khi thủy
tinh đặc cứng lại.
Tiến hành rửa vi quản đã kéo bằng cách chấm vào lọ thủy tinh có chứa aceton, lấy vi quản
ra và chấm vào giấy thấm để rút bỏ aceton. Làm lại vài lần để vi quản được sạch.
1.2 . Chấm mẫu lên tấm bản mỏng
1.2.1. SKLM bản nhỏ
Dụng cụ:
 Tấm bản mỏng thương mại 20x20cm
 Kéo cắt
 Thước
 Bút chì

1.3.2. Giải ly bản mỏng
Cách tiến hành
Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy thấm
(giấy lọc), nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình
được bão hòa).
Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và
ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi.
Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly.
Lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi. Tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc
trưng.
2. Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn
các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phương pháp hóa
học hoặc vật lý.
2.1. Phương pháp vật lý
Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV)
Dụng cụ:
 Đèn chiếu UV
 Viết chì
Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát
màu, nếu quan tâm thì dung viết chì khoanh lại.
2.2. Phương pháp hóa học:
Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng
Dụng cụ:
 Kẹp
 Máy sấy
 Cuộn băng keo
 Kéo
Hóa chất
 I

FeCl
3 H
2
SO
4
đđ

Vàng hoặc nâu
Vàng đậm đến da cam
Màu đỏ hoặc xanh dương –đỏ
Màu cam đến đỏ
Xanh lục đến xanh đen Màu tím
Hợp chất hữu cơ nói chung
Flavon, Flavonol
Chalcon, auron
Flavonoid

Sesquiterpen

Triterpen

Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô. Nếu hiện hình bằng hơi I
2
thì đặt

max
: 545nm)
Màu xanh dương đen (λ
max
: 595nm)

BÀI 3: CHIẾT XUẤT TINH DẦU

I. Mục đích:
Giúp sinh viên nắm được phương pháp tách chiết tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi
nước.
II. Cơ sở lý thuyết
Muốn khảo sát tinh dầu trong cây nên tiến hành việc lôi cuốn hơi nước trên mẫu cây tươi,
để tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi cao.
Nước khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu.
Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành
Dụng cụ
 Bình cầu, erlen
 Bếp đun, ống ngưng hơi
 Các ống nối bằng thủy tinh
Hóa chất
 Nước
 Vỏ bưởi, vỏ chanh
Cách tiến hành
Mẫu được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích
của cả mẫu và nước chỉ chiếm tối đa hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống và cắm bếp
điện đun nóng. Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang
BÀI 4: SẮC KÝ CỘT

I. Mục đích
Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu (cao etanol, metanol,
butanol) ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp
chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ.
II. Cơ sở lý thuyết
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra
riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối
với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh).
Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không là tùy vào hệ
số phân chia. Bất kỳ một hợp chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm hai pha (hai pha: lỏng-
lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với
một tỷ lệ nồng độ cố định, tỷ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và
của cả hai pha.
Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ
thống gồm hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi
loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật
sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất.
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường những hạt
có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần
phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để
không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly đươc đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía
dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải
ly.
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực
được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau:


Sắc ký cột hở (open-column chromatography)
Dụng cụ

 Cột thủy tinh (đường kính 1.5cm, cao 60cm)
 2 cái kẹp
 1 giá đỡ (giữ cột)
 1 becher 100ml, đũa thủy tinh
 Ống đong 100ml
 Bông gòn thấm nước
 Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (100ml, 50ml)

Hóa chất
 Silica gel (50-150µm)
 Eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat, metanol, acetone, nước.
IV. Cách tiến hành
Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography)
a) Nạp chất hấp thu vào cột
Ráp hệ thống gồm phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy bơm
hút tạo chân không, cho máy bơm hoạt động. Múc từng lượng nhỏ silica gel khô cho vào
phễu, dùng muỗng nén nhẹ silica gel xuống đáy phễu, mỗi lần mỗi ít, từng lớp, tạo thành
một khối rắn, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều dày lớp silica gel khoảng
5cm. Nếu cần tách một lượng mẫu chất nhiều hơn thì sử dụng phễu to hơn, có đường kính
lớn hơn.
Bảng 2: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký-nhanh cột khô.
Lượng mẫu Đường kính trong
của phễu (cm)
Chiều cao lớp hấp
thu
Phân đoạn dung
dịch giải ly (ml)

b) Chọn dung môi cho quá trình sắc ký cột
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ
dung môi giải ly cho phù hợp. Các bước tuần tự như sau:
+ Mẫu chất cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml. Gọi là
dd mẫu (A).
+ Chuẩn bị 5-6 tấm bản mỏng (2x5cm), chấm lên những tấm bảng này, mỗi chấm khoảng
2-5µl dung dịch mẫu (A).
+ Mỗi bảng được giải ly với các dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực khác nhau,
tiến hành hiện hình các vết ở mỗi bảng bằng UV hay thuốc thử.
+ Đối với mẫu cao khô chiết xuất từ cây cỏ (cao chứa các hợp chất từ ít phân cực đến phân
cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao
chiết lên vị trí ở bảng với R
f
= 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có
thể đẩy vết phân cức nhất của cao chiết với R
f
= 0,2.
c) Tỷ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột
- Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng: Trọng lượng chất hấp thu
phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu.
- Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong cột sắc ký: Chiều cao
chất hấp thu: đường kính trong của của cột = 10:1.
d) Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
- Giữ cho cột thẳng đừng trên giá, đầu ra của cột dùng miếng thủy tinh xốp hoặc miếng
bông gòn để chặn.
- Trong một becher đã có sẵn dung môi (dung môi đầu tiên cho quá trình giải ly cột), cho
chất hấp thu vào becher, đều đặn mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót, vừa khuấy nhẹ đều.
Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt, khiến cho bọt khí sẽ
bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.

BÀI 5: TÁCH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ CỘT

I. Mục đích
Sinh viên sẽ cô lập một vài hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp các chất ban đầu bằng
phương pháp sắc ký cột kết hợp với SKBM.
II. Cơ sở lý thuyết
Xem lai bài sắc ký cột và sắc ký bản mỏng
III. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
 Cột thủy tinh (sẽ được lựa chọn sau)
 2 cái kẹp (giữ cột)
 1 giá đỡ (giữ cột)
 2 becher, đũa thủy tinh
 Ống đong 100ml
 Bông gòn
 Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (các lọ bi)
 Kéo, vi quản đã kéo, bản mỏng (20x20cm)
 1 cái kẹp bản mỏng
 Máy sấy hoặc bếp điện để nướng bản
 Bình giải ly bản
 Đèn soi UV
 H
2
SO
4
50%
Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất