ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
PHẠM THỊ THỦY
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH
SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI,
NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CỦA CÂY GỪNG NÚI ĐÁ
(Zingiber purpureum Roscoe)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa: CNSH-CNTP
Khóa học: 2010-2014
Hệ đào tạo: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa: CNSH-CNTP
Khóa học: 2010-2014
Giảng viên hướng dẫn: 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
2. CN. Vi Đại Lâm
Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2014
Lời cảm ơn
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã tiến hành thực
hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh chồi, nhân nhanh và ra rễ của cây Gừng Núi Đá (Zingiber
purpureum Roscoe)”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học-
Công nghệ Thực phẩm, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết
quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh
học-Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt
nhất cho em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Ngô Xuân Bình và cô giáo
Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực
hiện đề tài.
các năm (2000-2011) 11
Bảng 2.7. Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính 14
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
đến khả năng tái sinh chồi của cây
Gừng Núi Đá (sau 20 ngày) 28
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
kết hợp với BA đến khả năng tái
sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (sau 20 ngày) 31
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
kết hợp với NAA đến khả năng tái
sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (sau 20 ngày) 34
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh của cây
Gừng Núi Đá (sau 40 ngày) 36
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
của cây Gừng Núi Đá (sau 40 ngày) 39
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Gừng
Núi Đá (sau 30 ngày) 41
Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA đến khả năng ra
rễ của cây Gừng Núi Đá (sau 30 ngày) 44
cây Gừng Núi Đá (sau 30 ngày) 46
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
2,4 D : 2,4 Diclorophenoxy acetic acid
BA : 6-Benzylaminopurine
Cs : Cộng sự
CT : Công thức
CV : Coeficient of Variation
Đ/c : Đối chứng
GA
3
: Gibberellic acid
IAA : Indole-3-acetic acid
IBA : Indole butyric acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LSD : Least Singnificant Difference Test
MS : Murashige & Skoog (1962)
MT : Môi trường
NAA : α-naphthalene acetic acid
TDZ : Thidiazuron
MỤC LỤC
MỤC LỤC 7
Phần 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
2.2.1.1. Tình hình sản xuất gừng trên thế giới 7
2.2.2.2. Tình hình tiêu thụ gừng trên thế giới 9
2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ gừng ở Việt Nam 10
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật 11
2.2.1. Khái niệm 11
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật 12
2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào 12
2.2.2.2. Sự phân hóa tế bào 12
2.2.2.3. Sự phản phân hóa tế bào 12
2.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 13
2.3.1. Vật liệu nuôi cấy 13
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy 13
2.3.3. Môi trường dinh dưỡng 13
2.3.3.1. Nguồn Cacbon 14
2.3.3.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng 14
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 21
3.2.2. Thời gian nghiên cứu 21
3.3. Nội dung nghiên cứu 22
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng (GA
3
, BA, NAA) đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe) 22
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng (BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh của cây Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe) 22
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng (NAA, BA) đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá (Zingiber
purpureum Roscoe) 22
3.4. Phương pháp nghiên cứu 22
3.4.1. Phương pháp tạo vật liệu vô trùng 22
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của
một số chất kích thích sinh trưởng (GA
3
, BA, NAA) đến khả năng tái sinh
chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 23
của cây Gừng Núi Đá. 26
3.4.4.2. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA đến
khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá. 26
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 27
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá 28
4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
đến khả năng tái sinh chồi của cây
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 28
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
kết hợp với BA đến khả năng tái sinh
chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 31
4.1.3. Kết quả ảnh hưởng của GA
3
kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh
chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 33
4.1.4. Kết quả ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh của cây Gừng
Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 36
phòng trị nhiều bệnh. Nhưng do nhu cầu của con người, ngày nay nguồn dược liệu
này đang bị khai thác quá mức và đứng trước nguy cơ cạn kiệt. Do đó việc bảo tồn,
duy trì và đảm bảo nguồn dược liệu cung ứng cho thị trường là một nhu cầu rất cấp
thiết. Việc áp dụng các kỹ thuật Công nghệ sinh học, đặc biệt là nhân giống in vitro
các cây dược liệu là một trong những biện pháp đem lại hiệu quả và bước đầu đã có
những kết quả khả quan, áp dụng vào thực tiễn đời sống. Cây thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae family) là một trong số những cây dược liệu được nghiên cứu. Cây
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) là một loài cây mới có giá trị về kinh tế
và y dược, tuy nhiên số lượng cây trong tự nhiên đang bị suy giảm nhanh chóng do
sự khai thác bừa bãi [10].
Những cây sinh sản bằng thân rễ nằm dưới đất như gừng thì việc nhân giống
theo phương pháp truyền thống bằng hạt, củ… là phương pháp thông thường tuy
nhiên có nhiều hạn chế: Hệ số nhân thấp, thân rễ dễ bị biến đổi và chết trong quá
trình sinh trưởng kéo dài, việc nhân giống gặp khó khăn do số lượng hoa và hạt ít,
hiệu quả nhân của các thế hệ sau bị giảm sút; mặt khác, cây dễ bị tấn công bởi
những tác nhân gây bệnh như Pythium spp. gây bệnh thối củ gừng, vi khuẩn gây
héo Ralstonia solanacearum…Sử dụng kĩ thuật nhân giống in vitro có ưu điểm là sẽ
tạo ra nguồn vật liệu sạch bệnh, cung cấp nguồn giống chất lượng tốt, đồng thời góp
phần bảo tồn nguồn gen cây dược liệu nói chung…[39]. Đã có một số nghiên cứu
về quy trình nhân giống in vitro Gừng cũng như những cây thuộc chi Zingiber [21],
[25], [35], [40], [43]. Trong quá trình nhân giống in vitro, thành phần môi trường và
điều kiện ngoại cảnh có thể được điều chỉnh để đạt được mục đích nuôi cấy. Trong
đó, thành phần và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng là một trong những yếu tố
được quan tâm nhất.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi,
nhân nhanh và ra rễ của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)”.
2
3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về chi Gừng (Zingiber)
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Các cây thuộc chi Gừng (Zingiber) là một trong số những loại gia vị quan
trọng và được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới. Hiện nay vẫn chưa xác định được
cụ thể trung tâm phát sinh của gừng. Tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng gừng bắt
nguồn từ khu vực Đông Nam Á. Hiện nay, các cây thuộc chi Zingiber chủ yếu phân
bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt của cả 2 bán cầu [39].
2.1.1.2. Phân loại
Theo Hoàng Thị Sản (2006) [13], chi Gừng được phân loại:
Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae)
Ngành (Phylum): Thực vật Hạt kín (Angiospermatophyta) hay Ngọc lan
(Magnoliophyta)
Lớp (Class): Một Lá mầm (Monocotyledonae) hay lớp Hành (Liliopsida)
Bộ (Order): Gừng (Zingiberales)
Họ (Family): Gừng (Zingiberaceae)
Chi (Genus): Zingiber
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Các cây thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) thường có thân rễ lớn, phân nhánh,
chứa nhiều chất dự trữ. Lá gồm bẹ dài ôm lấy nhau tạo thành thân giả, cuống ngắn,
phiến lớn, giữa cuống và bẹ lá có phần phụ gọi là lưỡi nhỏ. Thân lá thường có mùi
thơm. Hoa không đều, đài tràng hình ống, tràng chia làm 3 thùy, thùy giữa lớn hơn
2 thùy bên. Có một nhị sinh sản (ở vòng trong) với 2 bao phấn lớn; một cánh môi
hình bản lớn, màu sắc sặc sỡ, do 3 nhị ghép lại và biến đổi tạo thành, nằm đối diện
Hình 2.1. Một số hình ảnh của cây Gừng Núi Đá
a- Hình thái cây; b- Hoa; c- Lá; d- Thân rễ (củ)
2.1.4. Giá trị của một số loài cây thuộc chi Gừng (Zingiber)
2.1.4.1. Giá trị dinh dưỡng
Theo số liệu nghiên cứu của USDA (United States Department of
Agriculture), trong củ gừng tươi có chứa khá nhiều chất dinh dưỡng khác nhau.
Phân tích thành phần trong 100g phần củ ăn được có một số chất chính sau:
a b
c d
6
Gừng Núi Đá trong tự nhiên đang bị khai thác nhiều và ngày càng khan hiếm do có
giá trị cao, 1 kg có giá khoảng 1 triệu đồng [10].
2.1.4.3. Giá trị y học
Các cây thuộc chi Zingiber nói chung và các loại gừng nói riêng hầu hết đều
có hoạt tính dược học. Từ lâu nhân dân ta đã sử dụng Gừng vừa như 1 loại gia vị
7
đồng thời là thảo dược. Các bộ phận trên cây Gừng hầu như đều sử dụng được tuy
nhiên phổ biến nhất là thân rễ (thường gọi là củ) ở cả dạng tươi và khô.
Theo nghiên cứu gần đây, trong thân rễ (thường gọi là củ) gừng có chứa một
số thành phần chính như zingiberene, cineol, gingerol, shogaol…có hoạt tính dược
học, zingiberene giúp hỗ trợ tiêu hóa; gingerol và shogaol có tác dụng hạ nhiệt,
chống co thắt dạ dày; cineol có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn. Ngoài ra, tinh dầu
của củ gừng còn có hoạt tính kháng một số loại vi sinh vật [8].
Gừng Tía (Zingiber purpureum Roscoe) được dùng làm thuốc trị lỵ mạn tính,
trị giun cho trẻ em, dùng cho phụ nữ sau khi sinh, chữa thấp khớp, tiêu viêm, chữa
bong gân, đau cơ, cầm máu cho vết thương [3].
Gừng ta (Zingiber officinale Roscoe) có tác dụng tiêu đờm, giải độc, chữa cảm
mạo, chữa ho, chống nôn, là vị thuốc giúp hỗ trợ tiêu hóa, dùng trong trường hợp
kém ăn, rối loạn tiêu hóa,…Gừng khô sắc uống trị đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa;
gừng sao vàng chữa tê thấp, băng huyết; vỏ gừng còn dùng làm thuốc làm tiêu phù
thũng [3].
Gừng Gió còn gọi là Riềng Gió, Riềng Dại (Zingiber zerumbet Smith) được sử
dụng như một vị thuốc giúp kích thích tiêu hóa, tẩy độc, bồi dưỡng, người hay bị
hoa mắt, chóng mặt, phụ nữ sau khi sinh [3].
Cây Gừng Đá đã được xếp vào nhóm giống cây thực phẩm quý hiếm cần được
bảo tồn theo Quyết định 80/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn [18].
Theo Quyết định số 56/2007/QĐ-BNN năm 2007 “Về việc bổ sung 12 loài cây
Sản lượng
(tấn)
1 471 577 1 596 625 1 692 235 2 034 429 2 095 056
Nguồn: FAOSTAT, 2014 [27].
Từ bảng số liệu trên có thể nhận thấy, diện tích trồng gừng trên thế giới có xu
hướng giảm nhẹ, tuy nhiên sản lượng lại tăng dần qua các năm, từ 1 471 577 tấn
(năm 2006) lên 2 095 056 tấn (năm 2012).
Gừng được trồng nhiều ở các nước thuộc khu vực Châu Á, đây cũng là khu
vực có diện tích trồng gừng lớn nhất thế giới, năm 2008 tổng diện tích trồng gừng là
213 977 ha, chiếm 77,59% tổng diện tích trồng gừng của cả thế giới, đến năm 2012
diện tích tiếp tục tăng lên 265 649 ha (chiếm 82,46%). Sản lượng gừng thu hoạch
của khu vực này cũng cao nhất thế giới, năm 2008 đạt 1 382 762 tấn trong khi tổng
sản lượng của thế giới là 1 596 625 tấn [27].
9
Bảng 2.3. Diện tích và sản lượng trồng gừng của một số quốc gia giai đoạn
2010-2012
Quốc gia
Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012
Diện tích
(ha)
Sản
lượng
(tạ/ha)
Diện tích
(ha)
Sản
cũng là một loại thảo dược.
Gừng được sử dụng nhiều ở các nước thuộc khu vực Châu Á. Nhật Bản là thị
trường lớn nhất tiêu thụ gừng, với tổng khối lượng đạt 104 379 tấn (năm 2000), 101
208 tấn (năm 2004), 65 459 tấn (2011); những năm gần đây tuy khối lượng nhập
khẩu có xu hướng giảm nhưng vẫn là quốc gia dẫn đầu thế giới về nhập khẩu và
tiêu thụ gừng; tiếp đó là các nước như Hoa Kỳ, Anh, Hà Lan, Pakistan, Ả
Rập…[27].
Bảng 2.5. Khối lượng và giá trị nhập khẩu gừng của một số quốc gia qua các
năm (2004-2011)
Quốc gia
Năm 2004 Năm 2010 Năm 2011
Khối
lượng
(tấn)
Giá trị
(1000USD)
Khối
lượng
(tấn)
Giá trị
(1000USD)
Khối
lượng
(tấn)
Giá trị
(1000USD)
Nhật Bản 101 208 126 013 86 408 108 462 65 459 123 483
Hoa Kỳ 29 002 37 005 42 429 44 900 52 521 68 076
Anh 13 289 18 019 17 423 21 732 20 368 28 556
lợi kinh tế từ loại cây này như: Khảo nghiệm giống cây trồng vật nuôi và thủy sản
do Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ thực hiện tại tỉnh An Giang
năm 2005 về giống Gừng Nồi được trồng nhiều ở Long An, Ứng dụng mô hình
trồng gừng mới cho hiệu quả kinh tế cao ở Vĩnh Phúc, Dự án 3PAD của Bắc Kạn
đưa cây gừng vào trồng cho đồng bào Dao ở thôn Phiêng Tạc, xã Nhạn Môn, huyện
Pác Nặm.
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi
cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [11].
12
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng
dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác
nhau của thực vật với kích thước nhỏ [11].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [11].
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu
tiên cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật. Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế
bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế
bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của
cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận
lợi [17].
2.2.2.2. Sự phân hóa tế bào
Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào và
giai đoạn dãn của tế bào. Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng
riêng về cấu trúc và chức năng [14].
Ca(OCl)
2
-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl
2
-thủy ngân
clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [17].
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với mẫu
cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp
lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong
không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ và
môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt),
khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc [17].
- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ [17].
2.3.3. Môi trường dinh dưỡng
14
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và
phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành phần
và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và
mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:
2.3.3.1. Nguồn Cacbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức
dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo
và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi
cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất
hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [11].
2.3.3.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
- Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na,
2
.6H
2
O, CaCl
2
.2H
2
O
Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO
4
Lưu huỳnh Chủ yếu là SO
4
-
- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi
lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối
với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào
nuôi cấy.
Copyright: Tài liệu đại học ©