ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG ĐỨC HẠNH

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM
CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : CNSH – CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khóa học : 2010-2014


Khoa : CNSH – CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khóa học : 2010 - 2014
Giáo viên hướng dẫn 1 : Ths. Lương Hùng Tiến
Giáo viên hướng dẫn 2 : Ths. Nguyễn Thị Đoàn

Thái Nguyên, 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận văn mọi sự giúp đỡ đều đã
được cảm ơn và trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Thái nguyên ngày 29 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Trương Đức Hạnh
LỜI CẢM ƠN
Thực tập tốt nghiệp là một khâu rất quan trọng trong quá trình học tập của mỗi
sinh viên nhằm hệ thống lại toàn bộ lượng kiến thức đã học, vận dụng lý thuyết vào
thực tiễn, bước đầu làm quen với những kiến thức khoa học. Qua đó sinh viên ra
trường sẽ hoàn thiện hơn về kiến thức lý luận, phương pháp làm việc, năng lực công
tác nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau này.
Được sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm và Ban chủ
nhiệm khoa CNSH - CNTP, em đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả
năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc”.
Trong suốt quá trình thực tập em đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo, các
bạn trong lớp 42-CNSH, các chuyên viên nơi em thực tập tốt nghiệp.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
2.1. Tổng quan về nano bạc
3
2.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại
3
2.1.2. Giới thiệu về hạt nano bạc
3
2.1.3. Phương pháp phân tích hạt nano bạc
4
2.1.4. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
4
2.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
5
2.1.6. Ứng dụng nano bạc trong cuộc sống
6
2.2. Tổng quan về Chitosan
6
2.2.1. Nguồn gốc Chitin và Chitosan
6
2.2.2 Cấu trúc hóa học của Chitosan
8
2.2.3. Tính chất của Chitosan
9
2.2.3.1. Tính chất vật lý
9
2.2.3.2. Tính chất hóa học
11
2.2.3.3. Tính chất sinh học và độc tính của Chitosan
12

22
2.3.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn
22
2.3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
23
2.3.2.3. Đặc điểm hóa sinh
23
2.3.2.4. Cơ chế gây bệnh
23
2.3.3. Các chất có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm 24
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
25
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
25
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
26
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
28
3.1. Vật liệu nghiên cứu
28
3.1.1. Vật liệu
28
3.1.2. Chủng vi sinh vật thí nghiệm
28
3.1.3. Môi trường nuôi cấy
28
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
28
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
29

39
4.4.1. Khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano
bạc theo thời gian
39
4.4.2. Khả năng kháng vi khuẩn S. Typhimurium của chế phẩm phối hợp
Chitosan – nano bạc theo thời gian
40
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
42
5.1. Kết luận
42
5.1. Kiến nghị
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
43
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Escherichia coli E.coli
Salmonella Typhimurium S. Typhimurium
Minimum Inhibitory Concentration MIC
Colony forming unit CFU
Dgree of Deacetylation DDA
Deoxyribonucleic acid ADN
Messenger Ribonucleic acid mARN
De-ion DI
Ultraviolet-visble spectroscopy UV-VIS
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích.
3

Hình 4.5. Biểu đồ khả năng kháng E. coli của chế phẩm Chitosan – nano bạc 40
Hình 4.6. Khả năng kháng S. Typhimurium của chế phẩm Chitosan – nano bạc 41 1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, những mối quan tâm của con người về vấn đề sức
khỏe ngày càng cao thì vấn đề thực phẩm được con người rất chú trọng. Vấn đề
được đặt ra đòi hỏi thực phẩm phải đảm bảo an toàn vệ sinh khi sử dụng, thay vì
những hóa chất bảo quản từ đó việc tìm ra các vật liệu hay các chất bảo quản đảm
bảo an toàn khi sử dụng thực phẩm là rất cần thiết.
Bạc đã được sử dụng để điều trị bệnh y tế trong hơn 100 năm do thuộc tính
kháng khuẩn tự nhiên của nó. Từ khi công nghệ Nano ra đời thì ứng dụng của bạc
mới phát triển lên một tầm cao mới. Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào
việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano
bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm
lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm). Các hạt
Nano bạc có diện tích mặt rất lớn, gia tăng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn, và nâng
cao hiệu quả diệt khuẩn. Khả năng kháng khuẩn của nano bạc là nhờ vào các ion
Ag
+
, ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào
dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó,
khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có
thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này [4].
Chitosan là một polysaccharide tuyến tính là sự kết hợp ngẫu nhiên gồm β(1-
4)-D glucosamine và N-acetyl-D glucosamine. Chitosan thương mại có nguồn gốc


3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nano bạc
2.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại
Cấu hình electron của bạc: 1s
2
2s
2
2p
6
3s
2
3p
6
3d
10
4s
2
4p
6
4d
10
5s
1
Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm
Bán kính ion bạc: 0,23 nm
Bảng 2.1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích.
Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó

Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình
dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các
thuộc tính trên.
Hình 2.1: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc.
Do hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt Plasmon duy
nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử
dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc [17].
2.1.4. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và
nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể
hiện tính độc với con người [24].

5
Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ
đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta
thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp
chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều
trị các vết bỏng và khử trùng [6].
Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả
cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy
nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên
kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt
khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano.
2.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion
Ag
+
. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào
dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó,

vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt nấm mốc
làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình. Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học
cũng đang nghiên cứu ứng dụng nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu
cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ
nano sẽ có kích thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn
các thiết bị sử dụng các công nghệ truyền thống.
2.2. Tổng quan về Chitosan
2.2.1. Nguồn gốc Chitin và Chitosan
Chitin được Bracannot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch
chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra
nó. Năm 1823 Odier đã phân lập một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là
Chitin hay “Chitine” có nghĩa là lớp vỏ nhưng ông không phát hiện ra sự có
mặt của nitơ. Cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của
Chitin giống cấu trúc của cellulose [3].
Năm 1929 Karrer đun sôi Chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun tiếp 50
phút ở 160
o
C với kiềm bão hòa và ông đã thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc
trưng với thuốc thử, chất đó chính là Chitosan.

7
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa của Chitosan đã
được công bố từ năm 30 của thế kỷ XX.
Chitin là một polysaccharide tự nhiên quan trọng với số lượng lớn đứng thứ 2
sau cellulose. Chitin tồn tại trong động vật, một số loại nấm [3].
Hình 2.3: Một số loại giáp xác chứa Chitin
Trong động vật, Chitin là một phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động
vật không xương sống như: Côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong
động vật bậc cao monomer của Chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp
cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da.

) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ
các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozit, do
vậy Chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozo hoặc là poly β-
(1-4)-D-glucosamine
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của Chitin 9
- Công thức cấu tạo của Chitosan (C
6
H
11
O
4
N)
n
.
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của Chitosan
- Chitosan thu được nhờ phản ứng deacetyl hóa Chitin, biến đổi nhóm N-
acetyl (-COCH
3
) thành nhóm amin (-NH
2
) ở C
2
. Chitosan được cấu tạo từ các mắt
xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1-4-glucoside.
- Do quá trình deacetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu mức
độ deacetyl hóa (degree of deacetylaction–DDA) DDA > 50% gọi là Chitosan còn
DDA < 50% gọi là Chitin.

SO
4
[18].
+ Độ nhớt: Độ nhớt là nhân tố quan trọng dể xác định khối lượng phân tử của
Chitosan. Chitosan có phân tử lượng lớn làm cho dung dịch có độ nhớt cao. Một số
nhân tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử, nồng
độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH, nhiệt độ ảnh hưởng đến độ nhớt của
Chitosan. Ví dụ: Độ nhớt của Chitosan tăng khi thời gian khử khoáng tăng. Độ nhớt
của Chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này giảm, tuy
nhiên độ nhớt lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm. Độ nhớt của Chitosan cũng
bị ảnh hưởng bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu
âm), hóa học (xử lý bằng ozon), độ nhớt sẽ giảm khi thời gian và nhiệt độ xử lý
tăng. Dung dịch Chitosan bảo quản ở 4
°
C được cho là ổn định nhất [18].
+ Tính tan: Chitosan không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc
nhưng tan trong dung dịch đệm có pH<6. Các acid hữu cơ: Acetic, formic, lactic
thường được sử dụng để hòa tan Chitosan. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl
1% nhưng không tan trong H
2
SO
4
và H
3
PO
4
. Dung dịch acid acetic nồng độ cao tại
nhiệt độ cao có thể dẫn đến depolyme hóa Chitosan. Ở pH cao, có thể xảy ra hiện
tượng kết tủa hoặc đông tụ nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp với chất keo
anion [18].

3
trong
các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH
2
trong các mắt
xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin và amit.
+ Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-,
dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N
+ Chitosan là những polysaccharide mà các đơn phân được nối với nhau bởi
các liên kết β-1-4-glucoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học
như: Acid, base, tác nhân oxi - hóa và các enzyme thủy phân.
+ Trong phân tử Chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên
tử oxy và nitơ của nhóm chức có cặp electron chưa sử dụng nên chúng có khả
năng tạo phức với kim loại như: Hg
2+
, Zn
2+
, Cu
2+
, Ni
2+
, Co
2+
…. Tùy nhóm chức
trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau.
Ngoài ra Chitosan còn có một số phản ứng đặc trưng như:
+ Phản ứng Van-Wisselingh: Chitosan tác dụng với Lugol tạo dung dịch
màu nâu.

12

+ Độ an toàn và độ độc tích lũy

13
Chitosan được thử nghiệm độ an toàn (LD
50
) trên 123 con chuột trắng (18-
21g), chia làm 5 đợt với liều lượng tăng dần 0,0025-0,020g/ngày. Kết quả chuột vẫn
khỏe mạnh.
Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02g/con/ngày, cho uống
liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh.
+ Độc tố cấp tính
Trên 5 lô chuột nhắt (50 con) cho uống Chitosan với liều lượng 9g/kg thể
trọng. Theo dõi liên tục 72h. Không có con chuột nào chết. Chứng tỏ Chitosan an
toàn.
Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy Chitosan không gây tổn thương cho các
tổ chức, không gây phù nề tại chỗ trên thỏ và chuột.
Từ các thực nghiệm trên cho thấy Chitosan không gây độc tính tại chỗ, không
ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu của động vật
thực nghiệm.
Chitosan được sử dụng là chất phụ gia và làm sạch nước uống tại Mỹ [14].
2.2.4. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng
khuẩn của Chitosan
2.2.4.1. Đặc tính kháng khuẩn
Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của Chitosan đã chỉ ra rằng
Chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Chitosan có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm men, nấm
mốc. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan phụ thuộc vào các yếu tố như: Mức độ
deacetyl hóa, khối lượng phân tử của Chitosan, pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt
của các thành phần trong thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan đã được
nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã được giải thích

, Ca
2+
. Nồng độ
các ion kim loại lớn có thể làm mất tính chất kháng khuẩn của Chitosan, ngoại trừ
ảnh hưởng của Na
+
đối với Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng
Chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào. Khi sử dụng
Chitosan, một lượng lớn các ion K
+
với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus
aureus và nấm Candida albicans. Cả Chitosan phân tử lượng 50.000Da và 5.000Da
đều kháng tốt hai loại vi sinh vật trên nhưng Chitosan phân tử lượng 50.000Da làm
mất nhiều gấp 2-4 lần ion K
+
, ATP so với Chitosan 5.000Da. Điều này thể hiện cơ
chế kháng khuẩn khác nhau ở Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Hoạt
động kháng khuẩn của Chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6
loại vi khuẩn. Cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính
thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra
rằng khả năng kháng khuẩn giảm khi khối lượng nguyên tử tăng, nó tăng cao ở

15
nồng độ pH thấp và giảm khi có mặt ion Ca
2+
, Mg
2+
. Nồng độ ức chế thấp nhất
khoảng 0,03 -0,25% thay đổi tùy từng loại vi khuẩn và khối lượng phân tử
Chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy