ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
LƯƠNG THỊ DUNG Tên đề tài:KHẢO SÁT THỰC TRẠNG NHIỄM VI SINH VẬT HIẾU
KHÍ, Coliforms VÀ E. coli TRONG NƯỚC GIẢI KHÁT
TẠI THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : CNSH – CNTP
Lớp : LTK8 - CNSH
Khóa học : 2012 - 2014 Thái Nguyên, 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM


tình hướng dẫn, dìu dắt và luôn quan tâm giúp đỡ Em trong suốt quá trình học tập
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm, tập thể cô
chú, anh chị khoa xét nghiệm - Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên đã nhiệt
tình giúp đỡ trong quá trình tiến hành thí nghiệm cũng như tạo mọi điều kiện để Em
hoàn thành khóa luận.
Em xin được cảm ơn cơ sở đào tạo, Ban lãnh đạo Đai học Nông Lâm - Đại
học Thái Nguyên, cùng các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên Em trong suốt quá trình học
tập tại trường cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng, Em xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,
khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho Em học tập và hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp
Mặc dù đã cố gắng rất nhiều nhưng báo cáo cũng không thể tránh khỏi nhiều
thiếu sót, Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn để
khóa luận được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, Ngày … tháng… năm 2014
Sinh viên thực hiện
Lương Thị Dung
DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
TSVSVHK Tổng số vi sinh vật hiếu khí
VSVHK Vi sinh vật hiếu khí

CFU

Colony forming unit

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Bảng giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước giải khát đóng chai
không cồn 12

Bảng 3.1: Số lượng mẫu thu thập tại các địa điểm 13

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.3: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.4: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 4.1: Mức độ nhiễm TSVSVHK trong nước giải khát tại thành phố Thái
Nguyên 26

Bảng 4.2. Mức độ nhiễm Coliforms trong nước giải khát tại thành phố Thái
Nguyên 28

Bảng 4.3: Mức độ nhiễm E. coli trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên 30

Bảng 4.4: Bảng kết quả so sánh tỷ lệ nhiễm VSV trong nước giải khát 32

Bảng 4.5: Kết quả xác định mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E. coli 33DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Vi khuẩn Coliforms (ảnh chụp hiển vi điện tử) qua kính 7


2.1. Tổng quan về nước giải khát 3

2.1.1. Khái niệm 3

2.1.2. Lịch sử hình thành và phát triển 3

2.1.3. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam 4

2.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nước giải khát 6

2.2.1. Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí 6

2.2.2. Tổng quan về Coliforms 7

2.2.3. Tổng quan về E. coli 9

2.2.4. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước giải
khát đóng chai 12

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 13

3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 13

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 13

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 13

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 13


4.2. Đánh giá mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E. coli trong nước giải
khát 32

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1. Kết luận 35

5.2. Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu
khi mà xã hội không ngừng phát triển, cuộc sống con người không ngừng cải
thiện, tiện nghi và đầy đủ hơn. Con người không chỉ ăn no mặc ấm mà còn ăn
ngon mặc đẹp và quan trọng hơn hết sức khỏe con người được chăm sóc tốt và
chu đáo. Bên cạnh những mặt tích cực đấy thì mặt trái của vấn đề cũng rất đáng
quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực ăn uống, vệ sinh an toàn thực phẩm.
Các loại thực phẩm, đồ uống ngày nay rất phong phú về chủng loại,
màu sắc, thành phần và giá cả cũng như giá trị dinh dưỡng. Bên cạnh những
sản phẩm chất lượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém.
Mặc dù, việc kiểm định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ
quan chức năng thực hiện thường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết được
những sản phẩm kém chất lượng trôi nổi trên thị trường [18]. Do đó, người
tiêu dùng sử dụng những sản phẩm này sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nước giải khát
2.1.1. Khái niệm
Nước uống giải khát là loại thức uống không có cồn, có thể có gas và
bổ sung các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp.
2.1.2. Lịch sử hình thành và phát triển
Lịch sử nước giải khát bắt nguồn từ nguồn nước khoáng được tìm thấy
trong các dòng suối tự nhiên. Từ lâu, việc ngâm mình trong suối nước khoáng
được xem là tốt cho sức khỏe do tác dụng trị bệnh của khoáng chất có trong
nước suối. Các nhà khoa học cũng nhanh chóng phát hiện ra Carbon dioxide
(CO
2
) có trong các bọt nước khoáng thiên nhiên [15].
Các loại nước khoáng không gas (không CO
2
) đầu tiên được xuất hiện
vào thế kỷ 17 với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một ít mật ong.
Năm 1676, công ty Compagnie de Limonadiers (Pháp) độc quyền bán các loại
nước chanh giải khát. Đến năm 1767, Tiến sĩ Joseph Priestley – một nhà hóa
học người Anh đã pha chế thành công loại nước giải khát có gas. Ba năm sau,
nhà hóa học Thụy Điển Torbem Bergman cho phép sản xuất loại nước khoáng
nhân tạo với số lượng lớn. Tuy nhiên, mãi đến năm 1832 loại nước khoáng có
gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời hàng loạt của máy sản xuất nước có
gas trên thị trường [16].
John Mathws – cha đẻ nước giải khát Mỹ là người tiên phong trong lĩnh
vực kinh doanh nước giải khát ở Mỹ, ông nhập cư vào Mỹ từ năm 1832, trước
đó ông là người đi đầu trong ngành kinh doanh nước giải khát tại Anh.
Mathws đã học một số nguyên lý cơ bản về pha chế khí cacbonic và máy tạo

Hoa Kỳ [18].

5
2.1.3.2. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát tại Viêt Nam
Theo nhận định của GS. Phạm Song, Chủ tịch Tổng hội Y học Việt
Nam, nước ta là một trong những thị trường tiêu thụ nước giải khát không
cồn có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất thế giới. Giáo sư cũng cho biết thêm,
trung bình mỗi năm, một người Việt Nam mới chỉ uống khoảng 3 lít nước giải
khát đóng chai không cồn, trong khi mức bình quân của người Philippines là
50 lít trên năm. Đến năm 2012, tổng lượng đồ uống bán lẻ ở Việt Nam sẽ tăng
50% so với năm 2007. Mức tăng trưởng này chưa thể đáp ứng nhu cầu còn
quá lớn trong thời điểm hiện nay. Ông Nguyễn Thanh Phong, Cục phó Cục
An toàn Vệ sinh Thực phẩm (Bộ Y tế) cho biết thị trường nước giải khát Việt
Nam còn khá nhiều đới với doanh nghiệp trong nước [15].
Hiện nay, đa số người tiêu dùng đều hướng tới nhu cầu sử dụng những
thực phẩm từ tự nhiên. Những sản phẩm này không chỉ có lợi cho sức khỏe mà
còn thân thiện với môi trường. Nhiều doanh nghiệp Việt Nam sản xuất nước giải
khát đang triển khai những sản phẩm với thành phần tự nhiên, đảm bảo vệ sinh
an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu thực tế của người dân trong nước.
Trước sự thay đổi thị hiếu của thị trường, các doanh nghiệp sản xuất
nước giải khát đã lập tức thay đổi cơ cấu sản xuất, đầu tư dây chuyền sản xuất
ngày càng hiện đại, đồng thời nghiên cứu và cho ra đời những sản phẩm với
hương vị mới. Các hãng Vinamilk, Tribeco, Wonderfarm, Number One, … đã
tung ra thị trường nhiều loại nước trái cây: táo, xoài, nho, mãng cầu, trà xanh,
trà thảo mộc không đường dành cho người mắc bệnh tiểu đường hay không
thích uống có đường….để đáp ứng nhu cầu khách hàng. Hiện các doanh
nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng vượt mức so với trước
đây. Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng
30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà nhập khẩu cũng làm đa
dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo,

rằng có thể tồn tại những vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. Số lượng vi
khuẩn hiếu khí thấp thường đi đôi với thực phẩm an toàn. Do đó, chỉ tiêu tổng
số vi khuẩn hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ
an toàn của thực phẩm [4].

7
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên
môi trường thạch dinh dưỡng, được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành
khuẩn lạc (Colony Forming Unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể
tích thực phẩm [7].
Thuật ngữ “vi sinh vật hiếu khí” trong vệ sinh thực phẩm được hiểu là bao
gồm cả VSVHK và vi khuẩn yếm khí tùy tiện. Sự phân chia vi sinh vật thành hai
nhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng. Theo Avery S.M (1991) hệ vi
khuẩn được xác định thành hai nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng:
1. Nhóm vi sinh vật (VSV) ưa nhiệt: Phát triển tốt ở nhiệt độ 37
0
C và
ngừng phát triển ở 1
0
C.
2. Nhóm VSV ưa lạnh: Sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn.
Xác định TSVSVHK trong thực phẩm được sử dụng như là một nhân tố
chỉ điểm về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian chế biến, vận chuyển và
bảo quản thực phẩm. Nó được tin cậy là phương pháp tốt để ước lượng vi sinh
vật xâm nhập vào thực phẩm [7].
2.2.2. Tổng quan về Coliforms
2.2.2.1. Đặc điểm của Coliforms

Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực
phẩm. Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp
đến - 2
o
C và cao đến 50
o
C. Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm
ở 5
o
C tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng là 3 - 6
o
C. Ngưỡng
pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 - 9. Chúng phát triển tốt trên môi

9
trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 - 16 giờ ở 37
o
C,
phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp [7].
Nhiễm Coliforms với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc. Thời gian ủ bệnh từ 2
đến 20 giờ, bình thường là 4 - 7 giờ. Bệnh phát đột ngột, ít nôn mửa, đi phân
lỏng, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ, có trường hợp sốt cao, chân co
quắp. Bình thường sau 2 - 3 ngày sẽ khỏi, bị nặng sẽ kéo dài hơn [14].
Đặc điểm gây bệnh :
Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với loài duy nhất là E.coli,
Citrobacter, Kebsiella, Enterobacter. Đặc điểm gây bệnh của các chủng
Coliforms có trong hệ tiêu hóa của người bình thường là vô hại, chúng chỉ gây
bệnh ở những người có hệ miễn dịch bị tổn thương.
2.2.3. Tổng quan về E. coli
Escherichia coli (E. coli) là một dạng Coliforms ưa nhiệt. Năm 1885

I M V C
E. coli + + - -
E. aerogenes - - + +
Có 3 loại kháng nguyên được dùng để định nhóm kháng nguyên của
E. coli: Kháng nguyên O (kháng nguyên thân chịu nhiệt), kháng nguyên K
(kháng nguyên thân không chịu nhiệt), và kháng nguyên H (kháng nguyên
lông không chịu nhiệt) [6].
Một trong những đặc tính quan trọng của E. coli liên quan đến khả
năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là thời hạn sống sót của chúng. Chúng
thường chết đi sau khi cùng tồn tại trong một khoảng thời gian như các sinh
vật gây bệnh khác có trong ruột (có một số tài liệu cho thấy ở trong nước một
số vi sinh vật gây bệnh có sức chống chịu cao hơn). Ở thực phẩm qua các biện
pháp xử l ý như ướp lạnh, cấp đông, chiếu xạ, E. coli bị tiêu diệt trong khi một
số vi sinh vật khác vẫn chống chịu được và sống sót. Tương tự như vậy nước

11
qua xử lý vẫn chứa một số VSV gây bệnh trong khi E. coli có giá trị chỉ thị về
vệ sinh do tính chống chịu tương đối cao của chúng đối với pH thấp [7,13].
- Đặc tính sinh hóa:
E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường sinh hơi đặc biệt là lactose,
sinh Indol, không có urease, phản ứng methyl đỏ dương tính, có khả năng khử
nitrat thành nitrit. E. coli có enzyme tryptophanase, nếu trong môi trường có
tryptophan chúng sẽ phân giải tryptophan sinh indol [7, 15].
Những dòng E. coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh
khác nhau nhưng thường gặp nhất là các type O
6
H
16
, O
8

toàn thế giới. Những chủng E. coli này được phân loại theo tính chất gây bệnh
và có cơ chế gây bệnh khác nhau [12].
- Nhóm E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. Coli -
EPEC):
Nhóm E. Coli này là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở trẻ em đặc
biệt là ở những nước đang phát triển. EPEC còn liên quan tới những vụ dịch
tiêu chảy ở nhân viên y tế tại các nước phát triển. EPEC bám dính vào tế bào
tiết nhày ở niêm mạc ruột non, khả năng bám dính này được quy định bởi các
gen nằm trên nhiễm sắc thể. Hậu quả của nhiễm trùng do EPEC là tiêu chảy
toàn nước, thường tự khỏi nhưng cũng có thể chuyển thành mãn tính [12].
- Nhóm E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. col - ETEC)
- Nhóm E. coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive E. Coli - EIEC)
- Nhóm E. coli gây chảy máu đường ruột (Enterohaemorrhagic E. coli -
EHEC)
2.2.4. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước
giải khát đóng chai
Giới hạn cho phép VSV trong nước khoáng và nước giải khát đóng
chai, trong đó có nước giải khát không cồn được áp dụng theo tiêu chuẩn sau:
Bảng 2.1: Bảng giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước giải khát đóng
chai không cồn
SẢN PHẨM LOẠI VI SINH VẬT GIỚI HẠN VI SINH VẬT Nước giải khát
không cồn
TSVSVHK 10
2

Coliforms 10
E. coli Không có

Thái Nguyên.
Địa điểm lấy mẫu: Các quán tại chợ Đồng Quang, chợ Thái, chợ Nông
Lâm thành phố Thái Nguyên

14
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
3.3.1. Thiết bị nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 3.1
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Mã số
thiết bị
Hãng sản xuất Quốc gia
1 Cân phân tích 25210744 Sartorius Đức
2 Nối hấp tiệt trùng 80816 CL-32 LDP Nhật bản
3 Máy đo pH 252510410 Hana Itliha
4 Tủ ấm 37
0
C 10020040 Sanyo Eleectric Co,LTD Nhật bản
5 Tủ ấm 42
0
C D06057 Memmer Đức
3.3.2. Dụng cụ nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu sử dụng các dụng cụ được thống kê dưới bảng 3.2
Bảng 3.3: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
STT

Dụng cụ Nước sản xuất
1 Đèn cồn Việt Nam
2 Bình thủy tinh có dung tích 250 - 500ml Đức
3 Ống nghiệm loại 16 - 160 mm và lớn hơn Đức

3.5. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu
thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt nam
(TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO)
- TCVN 4882:2007 (ISO 4831:2006) Vi sinh vật trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform - kỹ thuật
đếm số có xắc suất lớn nhất.
- TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli giả
định - kỹ thuật đếm số có xắc suất lớn nhất.
- TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Định lượng tổng số vi sinh vật
hiếu khí trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Kết quả được so sánh với giới hạn cho phép theo quyết định số 46/2007/
QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y Tế về việc quyết định giới
hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm.
3.5.1. Kỹ thuật lấy mẫu xét nghiệm và bảo quản mẫu
- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ các quán tại chợ
Đồng Quang, chợ Thái, chợ Nông Lâm thành phố Thái Nguyên
- Cho mẫu vào túi nilon vô trùng, các lọ, hộp inox hấp sấy tiệt trùng và
ghi nhãn có các thông tin cần thiết (số bao gói, tên mẫu, địa chỉ mẫu, lô hàng
sản xuất, ngày lấy mẫu, ký hiệu, ). Khối lượng mẫu tối thiểu là 250ml.

16
- Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau và được vận
chuyển tới phòng xét nghiệm trong hộp xốp, bình cách nhiệt có chứa đá. Tại
phòng xét nghiệm mẫu được tiến hành xét thử nghiệm, với mẫu chưa tiến
hành thử nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp đối với từng loại mẫu.
3.5.2. Phương pháp xác định tổng số Coliforms có trong thực phẩm
Xác định chỉ tiêu Coliforms áp dụng theo TCVN 4882:2007 ISO
4831:2006 [3].

Chú ý: - Dùng một pipet vô trùng mới ở mỗi độ pha loãng
- Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu
sâu hơn 1cm
- Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng ban đầu

17
- Thời gian tiến hành:
* Từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi cấy không
vượt quá 45 phút.
* Từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các
dung dịch pha loãng tiếp theo không được vượt quá 30 phút.
- Độ pha loãng của mẫu phụ thuộc vào độ bẩn sạch của mẫu thử, sao
cho đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết
quả âm tính.
Phương pháp tiến hành
Bước 1: Nuôi cấy mẫu
- Với một mẫu phải nuôi cấy ở 3 đậm độ, mỗi đậm độ nuôi trong 3 ống
môi trường canh thang Lauryl sulfate, mỗi ống cho 1ml dung dịch mẫu thử
- Sau đó lắc đều môi trường và đem nuôi trong tủ ấm 37
0
C từ 24 - 48 giờ.
- Xác định ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính làm đục
môi trường và sinh hơi, sủi bọt khí)
Bước 2: Cấy chuyển
- Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấy
chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang BGBL, mỗi ống 1
ăng (tương ứng đậm độ mẫu thử).
- Sau khi cấy chuyển lắc đều, đặt trong tủ ấm 37
0
C trong vòng 24 - 48 giờ.