DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
TSVSVHK Tổng số vi sinh vật hiếu khí
VSVHK Vi sinh vật hiếu khí
CFU Colony forming unit
VSV Vi sinh vật
+ Dương tính
- Âm tính
EMB Eozin Methyl Blue
EPEC Enteropathogenic E. Coli
ETEC Enterotoxigenic E. coli
EIEC Enteroinvasive E. Coli
EHEC Enterohaemorrhagic E.coli
TCVN Tiêu chuẩn Việt nam
ISO Tiêu chuẩn quốc tế
QĐ - BYT Quy định – Bộ Y tế
MPN Most Probale Number
BGBL Canh thang Brilliant Green Bile Lactose
CT Canh thang
TP Thực phẩm
VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm
ST Sting
PS Pepsi
CO Coca Cola
OD Trà xanh O độ
C2 Trà xanh C2
BD Trà bí đao
E.coli Escherichia coli
KPH Không phát hiện
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Bảng giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước giải khát đóng chai

Trang 2
DANH MỤC CÁC HÌNH 3
Trang 3
MỤC LỤC 4
Trang 4
PHẦN 1
MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích của đề tài 2
PHẦN 2 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về nước giải khát 3
2.1.1. Khái niệm 3
2.1.2. Lịch sử hình thành và phát triển 3
2.1.3. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt
Nam 4
2.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nước giải khát 6
2.2.1. Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí 6
2.2.2. Tổng quan về Coliforms 7
2.2.3. Tổng quan về E. coli 9
2.2.4. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước giải
khát đóng chai 12
PHẦN 3 12
ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 12
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 13
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 13
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 13
3.3.1. Thiết bị nghiên cứu 13
3.3.2. Dụng cụ nghiên cứu 14

quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực ăn uống, vệ sinh an toàn thực phẩm.
Các loại thực phẩm, đồ uống ngày nay rất phong phú về chủng loại,
màu sắc, thành phần và giá cả cũng như giá trị dinh dưỡng. Bên cạnh những
sản phẩm chất lượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém.
Mặc dù, việc kiểm định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ
quan chức năng thực hiện thường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết được
những sản phẩm kém chất lượng trôi nổi trên thị trường [18]. Do đó, người
tiêu dùng sử dụng những sản phẩm này sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khỏe.
Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu
quả nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở
Việt Nam mà ngay cả các nước trên thế giới cũng vậy. Một trong những
nguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi
sinh vật gây hại trong thực phẩm [11].
Các loại nước uống thuộc các thương hiệu nổi tiếng: Pepsi, Lavie,
Sting, Coca Cola, trà xanh C2, trà xanh O độ, trà bí đao… được bày bán tràn
lan trên thị trường nên khả năng nhiễm vi sinh vật gây hại là rất cao. Chính vì
thế, các bệnh liên quan tới ăn uống như rối loạn tiêu hóa, hô hấp, tiêu chảy …
không ngừng phát triển thậm chí thành dịch ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
1
khỏe con người. Mà điển hình trong những loại vi sinh vật gây hại cho sức
khỏe con người có nhiều trong đồ uống phải kể tới đó là các vi sinh vật hiếu
khí, Coliforms và E. coli.
Từ thực tiễn trên để có biện pháp hạn chế tình trạng ngộ độc thực phẩm
và đánh giá chất lượng nước giải khát, chúng tôi tiến hành “Khảo sát thực
trạng nhiễm vi sinh vật hiếu khi, Coliforms và E. coli trong nước giải khát
tại thành phố Thái Nguyên.”
1.2. Mục đích của đề tài
Xác định được mức độ nhiễm chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí
(TSVSVHK), Coliforms và E. coli trong nước giải khát trên địa bàn thành

gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời hàng loạt của máy sản xuất nước có
gas trên thị trường [16].
John Mathws – cha đẻ nước giải khát Mỹ là người tiên phong trong lĩnh
vực kinh doanh nước giải khát ở Mỹ, ông nhập cư vào Mỹ từ năm 1832, trước
đó ông là người đi đầu trong ngành kinh doanh nước giải khát tại Anh.
Mathws đã học một số nguyên lý cơ bản về pha chế khí cacbonic và máy tạo
gas từ Joseph Bramah (nhà phát minh máy nén thủy lực từ thế kỷ thứ 18).
Mathws định cư hẳn tại Mỹ và bắt đầu cung cấp nước giải khát có gas cho các
3
cơ sở giải khát ở khu vực New York – thời gian này thường phổ biến loại
thức uống ướp lạnh nhưng không có hương vị nhờ tay nghề cao của Mathws
ngành công nghiệp nước giải khát Mỹ phát triển nhanh chóng [15].
Những thập niên sau đó – kể từ 1852, với việc nước gừng được tung ra
thị trường, các sản phẩm có thương hiệu đã xuất hiện và được cấp quyền kinh
doanh. Bắt đầu từ những năm 1880 đến nay, thị trường nước giải khát tràn
ngập các loại nước uống có nhãn hiệu như Coca Cola (1886), Moxie (1885),
Dr.Peppe (188), Pepsi Cola (1898)… [16].
2.1.3. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam
2.1.3.1. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới
Ngành công nghiệp nước giải khát trên thế giới đã hình thành và phát
triển từ rất lâu nhưng chỉ bùng nổ thực sự từ chiến tranh thế giới thứ hai và
kéo dài tới ngày nay mà điển hình nhất đó là Coca Cola và Pepsi. Tiêu thụ
toàn cầu vượt quá 327 tỷ lít mỗi năm, trong đó Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật là
những thị trường lớn nhất của ngành công nghiệp này. Do không ngừng mở
rộng thị trường nên hai hãng nước giải khát lớn này chi phối cổ phần thị
trường thế giới là tất nhiên. Coca Cola nắm khoảng một nửa thị phần thế giới
và bán 4 loại nước giải khát hàng đầu. Doanh thu bán hàng trong năm 2006
đạt 241 tỷ USD, lợi nhuận đạt 20% và hơn 400 dự án đang triển khai [16].
Xếp thứ hai và thứ ba thế giới trong ngành giải khát phải kể tới đó là
Pepsi và Cadbury Schweppes kiểm soát hầu hết thị phần còn lại. Doanh thu

nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng vượt mức so với trước
đây. Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng
30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà nhập khẩu cũng làm đa
dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo,
Welchs, Regain, Berri, Drwitt… Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất
5
nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tác
dụng thanh nhiệt: atiso, mía lau, sâm, bí đao…[16].
2.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nước giải khát
Theo ông Nguyễn Thanh Phong, thị trường nước giải khát Việt Nam
còn khá lớn đối với doanh nghiệp trong nước. Tuy nhiên theo ông Phong,
không vì thế mà doanh nghiệp Việt Nam lơ là việc nâng cao chất lượng, nhằm
đem đến những sản phẩm tốt nhất cho người tiêu dùng. Sự cạnh tranh trên thị
trường đồ uống ngày càng trở nên khốc liệt, đòi hỏi doanh nghiệp không
ngừng đẩy mạnh nghiên cứu, nhằm đưa ra những sản phẩm mới có chất lượng
cao. Vì thế ngày càng nhiều cơ sở sản xuất, các doanh nghiệp nước giải khát
được thành lập. Bên cạnh những hãng: Vinamilk, Pepsi, Tribeco, Coca
Cola…luôn luôn tung ra thị trường những sản phẩm mới cạnh tranh, hạ giá
thành, đáp ứng nhu cầu khách hàng. Tuy nhiên, không ít sản phẩm có giá
cạnh tranh nhưng chất lượng kém.
2.2.1. Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí
Vi sinh vật hiếu khí là tất cả các vi sinh vật có khả năng phát triển trong
môi trường thạch dinh dưỡng ở 30
o
C từ 24 – 48h với điều kiện hiếu khí. Tổng
số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi
mới hay nguy cơ hư hỏng của thực phẩm. Tổng số vi khuẩn hiếu khí còn có
thể chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng
số vi khuẩn hiếu khí có tác dụng nhất trong việc đánh giá chất lượng vệ sinh
của các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Tổng số vi

(Nguồn:http://thewatchers.adorraeli.com)
Các loại thực phẩm đạt tiêu chuẩn
vệ sinh là thực phẩm không nhiễm các
7
loại vi sinh vật nguy hiểm hoặc nhiễm ở mức độ an toàn. Nhìn chung, việc
kiểm tra từng sản phẩm thực phẩm có ô nhiễm vi khuẩn độc hại là không dễ
dàng. Hiện nay, ngoài chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, các chỉ tiêu đánh giá
tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm bao gồm hai nhóm vi khuẩn chính: Coliforms và
cầu khuẩn đường ruột (Enterococci) [9].
Coliforms và Feacal Coliforms còn là các nhóm sinh vật được dùng để
chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.
Nhóm Coliforms gồm những trực khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện, gram âm,
không sinh nha bào, lên men đường lactose và sinh hơi trên môi trường nuôi
cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này được chia thành hai nhóm
nhỏ là Coliforms và Feacal Coliforms có nguồn gốc từ phân các loài động
vật. Feacal Coliforms có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng,
bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella, và Enterobacter. Khi Coliforms
và Feacal Coliforms xuất hiện trong mẫu thì có khả năng mẫu bị nhiễm nước
nhiễm phân và có khả năng chứa các VSV gây bệnh hiện diện trong phân.
Trong các thành viên của nhóm Coliforms thì E. coli là loài được quan tâm
nhiều nhất về VSATTP [9].
Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực
phẩm. Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp
đến - 2
o
C và cao đến 50
o
C. Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm
ở 5
o

nhiệt độ thích hợp 42 - 44
0
C, pH trong khoảng 4,4 - 9, sinh indol ở 42 - 44
0
C,
9
Escherichia coli
www.foodpoisonblog.com
tạo độc tố mạnh. Những chủng điển hình sinh Indol, không có urease, phản
ứng đỏ methyl dương tính, lên men đường glucose có sinh hơi, lên men
đường mannit và lactose [9].
Trong các loại vi khuẩn nhóm Coliform, E. coli thường được dùng làm
chỉ tiêu đánh giá vì vi khuẩn này đặc hiệu cho sự ô nhiễm phân hơn
Enterobacter aerogenes. Để phát hiện E. coli, người ta sử dụng công thức
IMViC trong đó: I = khả năng sinh indol, M = phản ứng đỏ methyl, V =
Voges - Proskauer (khả năng sinh acetoin), và C = khả năng sử dụng citrate.
Dựa vào đó, hai vi khuẩn này được phân biệt như sau:
I M V C
E. coli + + - -
E. aerogenes - - + +
Có 3 loại kháng nguyên được dùng để định nhóm kháng nguyên của
E. coli: Kháng nguyên O (kháng nguyên thân chịu nhiệt), kháng nguyên K
(kháng nguyên thân không chịu nhiệt), và kháng nguyên H (kháng nguyên
lông không chịu nhiệt) [6].
Một trong những đặc tính quan trọng của E. coli liên quan đến khả
năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là thời hạn sống sót của chúng. Chúng
thường chết đi sau khi cùng tồn tại trong một khoảng thời gian như các sinh
vật gây bệnh khác có trong ruột (có một số tài liệu cho thấy ở trong nước một
số vi sinh vật gây bệnh có sức chống chịu cao hơn). Ở thực phẩm qua các biện
pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông, chiếu xạ, E. coli bị tiêu diệt trong khi một

sinh trưởng nhanh trong các môi trường thích hợp khác. Do đó, sự xuất hiện
của E. coli trong thực phẩm là dấu hiệu của sự ô nhiễm phân và người tiêu
dùng có thể nhiễm phải các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác như
Salmonella khi tiêu thụ các thực phẩm này. E. coli là chỉ tiêu đánh giá với
các thực phẩm sống hoặc các thực phẩm không cần xử lý nhiệt trước khi sử
dụng [13].
2.2.3.3. Các chủng E. coli liên quan tới ngộ độc thực phẩm
E. coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy tiện, không sinh bào tử,
khá phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người và
động vật. Chúng thuộc loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red
dương tính song có phản ứng VP và citrate âm tính. Cách hữu hiệu nhất để
định danh loài là xác định kiểu huyết thanh, dùng kháng thể tương hợp với
kháng nguyên O, H và K của các chủng E. coli khác nhau.
E. coli gây tiêu chảy và ngộ độc thực phẩm là loại phổ biến nhất trên
toàn thế giới. Những chủng E. coli này được phân loại theo tính chất gây bệnh
và có cơ chế gây bệnh khác nhau [12].
11
- Nhóm E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. Coli -
EPEC):
Nhóm E. Coli này là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở trẻ em đặc
biệt là ở những nước đang phát triển. EPEC còn liên quan tới những vụ dịch
tiêu chảy ở nhân viên y tế tại các nước phát triển. EPEC bám dính vào tế bào
tiết nhày ở niêm mạc ruột non, khả năng bám dính này được quy định bởi các
gen nằm trên nhiễm sắc thể. Hậu quả của nhiễm trùng do EPEC là tiêu chảy
toàn nước, thường tự khỏi nhưng cũng có thể chuyển thành mãn tính [12].
- Nhóm E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. col - ETEC)
- Nhóm E. coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive E. Coli - EIEC)
- Nhóm E. coli gây chảy máu đường ruột (Enterohaemorrhagic E. coli
- EHEC)
2.2.4. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước

6 C2 2 2 1
Tổng số mẫu 12 12 6
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Khảo sát, đánh giá thực trạng nhiễm TSVSVHK, Colifoms và E. coli
trong một số nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Thời gian từ 3/2014 đến 6/2014
Địa điểm ngiên cứu: Khoa xét nghiệm – Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh
Thái Nguyên.
Địa điểm lấy mẫu: Các quán tại chợ Đồng Quang, chợ Thái, chợ Nông
Lâm thành phố Thái Nguyên
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
3.3.1. Thiết bị nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 3.1
13
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Mã số
thiết bị
Hãng sản xuất Quốc gia
1 Cân phân tích 25210744 Sartorius Đức
2 Nối hấp tiệt trùng 80816 CL-32 LDP Nhật bản
3 Máy đo pH 252510410 Hana Itliha
4 Tủ ấm 37
0
C 10020040 Sanyo Eleectric Co,LTD Nhật bản
5 Tủ ấm 42
0
C D06057 Memmer Đức
3.3.2. Dụng cụ nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu sử dụng các dụng cụ được thống kê dưới bảng 3.2

3.5. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu
thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt nam
(TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO)
- TCVN 4882:2007 (ISO 4831:2006) Vi sinh vật trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform - kỹ thuật
đếm số có xắc suất lớn nhất.
- TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli giả
định - kỹ thuật đếm số có xắc suất lớn nhất.
- TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Định lượng tổng số vi sinh vật
hiếu khí trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Kết quả được so sánh với giới hạn cho phép theo quyết định số 46/2007/
QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y Tế về việc quyết định giới
hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm.
3.5.1. Kỹ thuật lấy mẫu xét nghiệm và bảo quản mẫu
- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ các quán tại chợ
Đồng Quang, chợ Thái, chợ Nông Lâm thành phố Thái Nguyên
- Cho mẫu vào túi nilon vô trùng, các lọ, hộp inox hấp sấy tiệt trùng và
ghi nhãn có các thông tin cần thiết (số bao gói, tên mẫu, địa chỉ mẫu, lô hàng
sản xuất, ngày lấy mẫu, ký hiệu, ). Khối lượng mẫu tối thiểu là 250ml.
15
- Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau và được vận
chuyển tới phòng xét nghiệm trong hộp xốp, bình cách nhiệt có chứa đá. Tại
phòng xét nghiệm mẫu được tiến hành xét thử nghiệm, với mẫu chưa tiến
hành thử nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp đối với từng loại mẫu.
3.5.2. Phương pháp xác định tổng số Coliforms có trong thực phẩm
Xác định chỉ tiêu Coliforms áp dụng theo TCVN 4882:2007 ISO
4831:2006 [3].
3.5.2.1. Nguyên tắc

- Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu
sâu hơn 1cm
- Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng ban đầu
16
- Thời gian tiến hành:
* Từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi cấy không
vượt quá 45 phút.
* Từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các
dung dịch pha loãng tiếp theo không được vượt quá 30 phút.
- Độ pha loãng của mẫu phụ thuộc vào độ bẩn sạch của mẫu thử, sao
cho đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết
quả âm tính.
Phương pháp tiến hành
Bước 1: Nuôi cấy mẫu
- Với một mẫu phải nuôi cấy ở 3 đậm độ, mỗi đậm độ nuôi trong 3 ống
môi trường canh thang Lauryl sulfate, mỗi ống cho 1ml dung dịch mẫu thử
- Sau đó lắc đều môi trường và đem nuôi trong tủ ấm 37
0
C từ 24 - 48 giờ.
- Xác định ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính làm đục
môi trường và sinh hơi, sủi bọt khí)
Bước 2: Cấy chuyển
- Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấy
chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang BGBL, mỗi ống 1
ăng (tương ứng đậm độ mẫu thử).
- Sau khi cấy chuyển lắc đều, đặt trong tủ ấm 37
0
C trong vòng 24 - 48 giờ.
- Xác định số ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: làm đục
canh thang và sinh hơi).


Hình 3.1: Sơ đồ phương pháp xác định Coliforms trong thực phẩm
theo phương pháp MPN
19
1. Đồng nhất và pha loãng
u
45ml dung dịch
pha loãng
5ml
mẫu
10
-2
CT
Lauryl
sulfat
37
0
C/
24h- 48h
10
-3
9 mL
Dung dịch
pha loãng
Canh thang BGBL
37
o
C/ 24h – 48h
3. Cấy
chuyển