BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THU TRANG
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế,
trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan
tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 8
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Doxorubicin 2
1.1.1. Đại cương về doxorubicin 2
1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3
1.2. Đại cương về liposome 4
1.2.1. Khái niệm 4
1.2.2.1. Ưu điểm 4
1.2.2.2. Nhược điểm 5
1.2.3. Phân loại 6
3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp
pha loãng ethanol 19
3.2.1. Quy trình bào chế chung 19
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế
đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa 20
3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi 20
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 24
3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy
trình bào chế 27
3.2.3. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome
doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 29
3.2.3.1. Quy trình bào chế 29
3.2.3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra 30
3.3. Bàn luận 32
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
11
USP
Dược điển Mỹ
12
DĐVN
Dược điển Việt Nam
13
TMT-LS
Liposome tác động vào khối u di căn
14
EE
Hiệu suất liposome hóa
15
PEG
Polyethylen glycol
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 2.1
Các nguyên vật liệu được sử dụng.
14
Bảng 3.1
28
Bảng 3.9
Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa
31
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên các hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1
Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid.
2
Hình 1.2
Cấu trúc liposome.
4
Hình 1.3
Kích thước một số loại liposome.
6
Hình 1.4
Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng.
9
Hình 3.1
Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin.
18
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều
ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa
trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào
chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên
thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế
bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược
chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm
chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc
biệt để đạt tác dụng hướng đích…
Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được
đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc
tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn
nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu về
liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy
nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không
đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi
trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy
mô công nghiệp…
Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược
điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome
doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục
đích:
1. Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol.
2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra.
- Công thức phân tử:
C
27
H
29
NO
11
. HCl.
- Khối lượng phân tử:
579,99.
3
Khoảng 40 – 50% bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5%
bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không qua hàng rào máu não
nhưng qua nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa [2], [5], [22].
Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do.
Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần
hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Các liposome doxorubicin phân bố
nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường. Dạng liposome doxorubicin
không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương
cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [5], [22].
- Chỉ định chính: ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing,
u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin,
ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thư đường tiết niệu và sinh
dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em:
Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp… [2].
Chỉ định tương đối: ung thư tuyến tiền liệt, cổ tử cung, âm đạo, dạ dày. Có tác dụng
đáp ứng miễn dịch khi đưa vào tuần hoàn do vậy liposome được coi là hệ vận chuyển
thuốc có tính tương hợp sinh học cao nhất [23].
- Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân nước và dược chất thân dầu.
Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước
và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [18].
- Cấu tạo và tính chất hóa lý tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm
qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của dược chất, mang các dược chất chữa bệnh nội
bào [3], [4].
5
- Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức
bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome do đó làm
thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [23].
- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số dược chất có độc tính cao, dùng liều
thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn do đó làm giảm phân bố thuốc tại
cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với dược chất tự do, làm giảm độc tính và tác
dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm dược chất [3], [4], [23].
- Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi
của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng
trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa… làm tăng độ tan của dược chất hoặc kéo
dài tác dụng của thuốc [3], [4].
1.2.2.2. Nhược điểm
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng liposome hiện nay vẫn chưa được sử dụng rộng
rãi do một số nhược điểm sau:
- Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của liposome ngắn.
Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài [4].
- Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong quá
trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự thống nhất giữa các lô mẻ nên khó triển khai
tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả
năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các
tế bào bình thường [1], [5], [7].
- Liposome hiện đại: Cấu trúc được thay đổi để khắc phục nhược điểm của
liposome quy ước nhằm tạo ra một hệ mang thuốc hiệu quả gồm:
+ Liposome gắn các yếu tố ổn định (long circualating liposomes): độ ổn định cao,
thời gian tồn tại trong tuần hoàn từ vài ngày đến hàng tuần [4], [5], [7], [20].
+ Liposome miễn dịch (immune liposomes): bề mặt gắn kháng thể, có khả năng
liên kết với receptor đặc trưng tại cơ quan đích, có thể giải phóng dược chất tại ngoại
bào gần tế bào đích [4], [5], [7], [20].
+ Liposome miễn dịch tồn tại lâu trong tuần hoàn (long circulating immune
liposomes): liposome kết hợp ưu điểm của liposome tồn tại lâu trong tuần hoàn và
7
liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome
[1], [4].
+ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome) [1], [4].
+ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) [1], [4].
+ Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển
gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [4].
+ Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp
ứng miễn dịch cho cơ thể [4], [13].
+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat
hóa tạo hỗn dịch liposome [4].
+ Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol,
isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [4].
+ Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế
từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri
liposome. Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển
pha của lipid T
c
, thông thường từ 50 – 60
o
C. Dược chất được phối hợp vào liposome
theo cơ chế chủ động hoặc thụ động. Phương pháp này thu được liposome nhiều lớp,
kích thước không đồng nhất (từ 50-1000 nm) [3], [4], [19].
1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham (bơm ether)
Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 – 65
o
C.
Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ether. Bơm từ từ dung dịch ether vào
dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether sẽ bốc hơi tạo thành
liposome to một lớp có kích thước 200 – 1000 nm. Phương pháp tiến hành nhanh
nhưng hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi,
có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm [3], [4], [19].
Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác [4], [17]:
- Phương pháp bốc hơi pha đảo.
- Phương pháp đông khô.
- Phương pháp dùng chất diện hoạt.
- Phương pháp màng tiếp hợp.
- Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn.
- Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn.
9
1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol
So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có ưu
độ khuấy trộn; tỷ lệ thể tích ethanol/đệm…[4], [17].Trong nghiên cứu về ảnh hưởng
của các yếu tố trên được tiến hành bởi Kremer và cộng sự năm 1977 đã chỉ ra rằng
tốc độ tiêm không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome [17].
Một số dung môi thân nước có thể thay thế cho ethanol như propanol, isopropanol,
ethyl acetat… Đặc biệt trong trường hợp ethanol ảnh hưởng đến độ ổn định của dược
chất [12].
Dược chất được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất đa dạng như
enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolon [17], beclomethason với
hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [14]. Dược chất có thể gắn theo cơ chế thụ động:
dược chất thân nước được hòa tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hòa tan
trong ethanol. Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động: thường áp dụng với dược chất
thân nước. Theo cơ chế thụ động dược chất thân dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome
rất cao (~100%), hiệu suất gắn của dược chất thân nước rất thấp (~16%). Kích thước
và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất. Từ đó
cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa dược chất
thân dầu [15].
Bên cạnh đó, phương pháp pha loãng ethanol còn tồn tại nhiều hạn chế như: giới
hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol (40mM đối với phosphatidylcholin) và
tỷ lệ thể tích ethanol/pha đệm (≤ 7,5 v/v) do đó liposome thu được thường bị pha
loãng; hiệu suất liposome hóa thấp đặc biệt với các dược chất thân nước, dung môi
ethanol tồn dư cần được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách…[4], [17], [19].
Phương pháp pha loãng ethanol hiện được ứng dụng nhiều trên thế giới, được sử
dụng nhiều trong các nghiên cứu bào chế liposome.
Năm 2008, Johnston Micheal J. W. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome
DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol. Các lipid được sử dụng là disteroyl
phosphatidylcholin, cholesterol, spingomyelin trứng được hòa tan trong ethanol, bơm
vào dung dịch MgSO
1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới
Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều sự
quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học.
Zhaohui Wang và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch
gắn peptid hướng đích trong điều trị ung thư di căn (TMT-LS) sử dụng liposome có
gắn một peptid hướng đích di căn ung thư cụ thể. Liposome được bào chế bằng
phương pháp hydrat hóa film (SPC: CHL: DSPE PEG = 20: 10: 2) hydrat hóa bằng
123mM amoni sulfat, siêu âm trong 30 phút sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-50
thu lấy các liposome có kích thước 100 nm, nạp DOX nhờ phương pháp tạo chênh
12
lệch pH, tinh chế liposome bằng phương pháp lọc trên gel. Sau quy trình bào chế thu
được các TMT-LS có kích thước 94,41 ± 0,1 nm, hiệu suất liposome hóa gần 100%.
Phân tích qua đo dòng tế bào cho thấy nồng độ TMT-LS-DOX tập trung tại dòng tế
bào ung thư di căn (MDA-MB-435S và MDA-MB-23J) cao hơn hẳn so với LS-DOX
trong khi đó không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ dược chất tại khối u giữa
TMT-LS-DOX và LS-DOX ở dòng tế bào ung thư không di căn (MCF-7). Sau 14
ngày, kích thước khối u từ 6,6 ± 1,57 cm giảm xuống 3,63 ± 0,37 cm khi điều trị bằng
LS-DOX và 1,71 ± 0,33 cm khi sử dụng TMT-LS-DOX [24].
Antonella Accardo và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng của liposome DOX gắn nhóm peptid MonY-BN tới các receptor bombesin tại
tế bào ung thư (DSPC-MonY-BN-DOX). Liposome với thành phần bao gồm DSPC
và MonY-BN (tỷ lệ mol 97: 3) được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo,
được đùn qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 100 nm nhờ áp suất khí Nitơ tạo
ra liposome đường kính 145,5 ± 31,5nm và chỉ số đa phân tán PDI 0,2 ± 0,05, thế
Zeta -12,8 ± 3,6mV. Nạp DOX bằng phương pháp chênh lệch pH sử dụng đệm
HEPES pH 7,4 bên ngoài liposome, hiệu suất liposome hóa 95,0 ± 2,7%. Liposome
DSPC/MonY-BN tập trung trong tế bào PC-3 là 2,7% ± 0,3% ở 37
và đánh giá tác dụng của chế phẩm trên khối u động vật. Liposome được bào chế
bằng phương pháp hydrat hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược
chất đưa vào liposome bằng phương pháp chủ động thông qua tạo chênh lệch pH giữa
hai bên màng bằng thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường
bên ngoài liposome. Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm. Liposome thu được có
KTTP < 200 nm, hiệu suất liposome hóa > 80%. TCCS cho thuốc tiêm liposome
DOX đã được đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW. Đánh giá tác
dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc
tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da. Tuy nhiên
nghiên cứu vẫn chưa giải quyết được những nhược điểm chung của phương pháp
hydrat hóa màng film (quy trình kéo dài, nhiều công đoạn, cần siêu âm làm giảm kích
thước tiểu phân…) [5].
14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Liposome.
- Liposome DOX.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng.
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu
chuẩn
TKHH
8
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether))
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
9
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ
TCCS
10
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
11
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH
12
Dung dịch tiêm truyền glucose 5%
Việt Nam
DĐVN
2.1.3. Phương tiện nghiên cứu
- Bể điều nhiệt (hãng Buchi-Đức).
- Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao Unidriver X1000.
- Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros
®
Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ
10kD, diện tích lọc 20cm
C.
2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin
2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước
tiểu phân
- Hình thức: liposome doxorubicin sau khi được bào chế phải là hỗn dịch đục mờ
màu đỏ cam, để lâu có thể bị lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ
16
- Hình dạng và cấu trúc liposome: sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền
qua với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome.
- KTTP và phân bố KTTP: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với
thiết bị Zetasizer ZS90. Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính
trung bình (Z
average
), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân
tán (PDI).
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất
liposome hóa
- Xây dựng đường chuẩn định lượng DOX tự do ở bước sóng 233 nm, DOX toàn
phần ở bước sóng 481 nm, xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu hiện tương quan
giữa mật độ quang và nồng độ DOX.
- Định lượng DOX toàn phần: tiến hành theo các nghiên cứu được tham khảo trước
đó [1], [7], với các giai đoạn chính:
+ Phá vỡ cấu trúc liposome bằng Triton 10%.
+ Pha loãng đến tỷ lệ thích hợp, đo quang ở 481 nm [1], [7].
+ Nồng độ DOX.HCL toàn phần tính theo công thức:
C
tp
=
D
N
D
C
× 𝐶
c
× KD
N
,D
C
: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo
17
C
N
: Hàm lượng DOX tự do của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml).
C
C
: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml).
K: Hệ số pha loãng.
- Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX được gắn vào liposome).
Tính theo công thức:
H =
C
lây nhiễm qua dụng cụ, môi trường thí nghiệm và tiếp xúc trực tiếp. Các thí nghiệm
được tiến hành trong điều kiện:
- Khu vực thí nghiệm riêng biệt, tránh ánh sáng, được vệ sinh trước và sau làm thí
nghiệm. Có thiết bị bảo hộ cho người làm nghiên cứu.
- Trang thiết bị, dụng cụ dùng xong phải được xử lý riêng. Các dụng cụ được ngâm
với dung dịch sulfocromat để oxy hóa hết DOX.
- Các chất thải được ngâm với sulfocromat trước khi xử lý riêng.
Copyright: Tài liệu đại học ©