BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯƠNG THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY
TÍA TÔ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ
MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT,
TỈNH LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LƯƠNG THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu và phân tích mẫu.
Khóa luận không thể được hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ quý báu
của PGS.TS. Panee Sirisaard – Khoa Dược, Đại học Chiang Mai, Thái Lan và
ông Thanach Sathapanachai – Công ty Jingabell Biotech Co. LTD, Thái Lan
trong hoạt động hợp tác nghiên cứu thành phần dầu hạt Tía tô trắng.
Tôi gửi lời tri ân đặc biệt tới anh Vàng Văn Sưởng cùng bà con dân tộc
Giáy xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong
quá trình thu mẫu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Đoàn Thị Phương – Đại học Dược
Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên và
các bạn nghiên cứu khoa học – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội,
đã luôn giúp đỡ, và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi có thể hoàn thành tốt quá
trình làm thực nghiệm trên bộ môn.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ông bà, bố mẹ và các bạn đã
luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và trong thời gian
nghiên cứu đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
SINH VIÊN Lương Thị Kim Chi
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 15
2.2.3. Nghiên cứu trình tự di truyền 15
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 19
3.2. Đặc điểm vi phẫu 21
3.2.1. Vi phẫu thân 21
3.2.2. Vi phẫu lá 23
3.3. Trình tự di truyền đoạn DNA ribosome nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 24
3.3.1. Tách chiết DNA 24
3.3.2. Xác định trình tự rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 25
3.3.3. So sánh trình tự gen với các trình tự gen của Perilla frutescens đã công
bố trên Genbank 25
3.4. Hàm lượng các thành phần trong dầu hạt Tía tô P1 27
3.4.1. Các acid béo 27
3.4.2. Hàm lượng Omega 3,6,9 29
3.4.3. Thành phần Vitamin E 29
3.5. Bàn luận 30
3.5.1. Về thực vật 30
3.5.2. Về trình tự đoạn rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 31
3.5.3. Về thành phần dầu hạt Tía tô P1 32
KẾT LUẬN 39
KIẾN NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
:

:
Eicosapentaenoic acid
FAPAS
:
Food Analysis Performance Assessment Scheme (Hệ thống
đánh giá, phân tích thực phẩm)
GC
:
Gas chromatography (Sắc ký khí)
GLC
:
Gas Liquid Chromatography (Sắc ký khí lỏng)
HDL
:
High-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao)
HPLC
:
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu
năng cao)
IL-1β
:
Interleukin-1β
ITS
:
Internal transcribed spacer (Vùng phiên mã nội)
LDL
:
Low-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp)

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng 6
Hình 1.2: Cấu tạo của triacylglycerol 8
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của các acid béo no, đơn không no, đa không no
chính trong dầu hạt Tía tô. 8
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng mẫu P1 19
Hình 3.2: Phân tích hoa mẫu P1 20
Hình 3.3: Chi tiết vi phẫu thân mẫu P1 22
Hình 3.4: Chi tiết vi phẫu lá mẫu P1 23
Hình 3.5: Điện di sản phẩm DNA toàn phần và sản phẩm PCR 24
Hình 3.6: Sắc ký đồ trình tự DNA theo chiều 5’-3’ mẫu P1 với cặp mồi ITS1-
ITS4 25
Hình 3.7: Kết quả gióng hàng trình tự rADN của mẫu P1 với ngân hàng gen
sử dụng công cụ Blast. 26
Hình 3.8: Quả (“Hạt”) của Tía tô: (a) Trung Quốc, (b)Thái Lan, (c) P1 và (d)
mẫu “Tô tử” ở chợ Lãn Ông. 31
Hình 3.9: Dầu hạt Tía tô Okinawa Perilla oil (Aman Prana, Đức) với nhãn giá
trị dinh dưỡng 351

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tía tô (Perilla frutescens L. Britton), họ Bạc hà (Lamiaceae), là cây cỏ
mọc quanh năm, đã được sử dụng lâu đời trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Trong loài P. frutescens L. Britton, có hai thứ chính thường gặp được phân

1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố của loài Perilla frutescens L. Britton.
Cây cỏ mọc thẳng đứng, cao 50-150 cm. Thân vuông, màu xanh hay
tím nhạt, có lông đa bào thưa hoặc dày đặc. Lá hình trứng rộng hay gần tròn,
cỡ 5-15 x 3-10 cm, chóp lá nhọn, gốc tù, tròn hay hình nêm, mép xẻ răng cưa
to và sâu, 2 mặt màu xanh hay tím nhạt, có lông đa bào dày; gân bên 7-8 đôi;
cuống lá dài 2-5 cm. Cụm hoa dạng chùm ở đỉnh cành, dài 5-20 cm, mỗi đốt 2
hoa mọc đối. Lá bắc hình trứng, dài hơn hoa, có lông đa bào dài. Hoa lưỡng
tính, mọc thẳng hoặc vòng, có cuống dài 1-3 mm. Đài hình chuông, cỡ 3-4 x
2-2,5 mm, có lông đa bào và điểm tuyến ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2
môi: môi trên 3 thùy ngắn; môi dưới 2 thùy nhọn và dài hơn môi trên, đài quả
đồng trưởng cỡ 7-10 x 3,5-4,5 mm. Tràng hoa màu tím nhạt, dài 5-6 mm, có
lông ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2 môi: môi trên 2 thùy xẻ nông; môi
dưới 3 thùy với thùy giữa lớn, không có khuyết ở đỉnh. Nhị 4, thụt trong ống
tràng, 2 nhị dưới dài hơn 2 nhị trên; bao phấn 2 ô song song. Bầu nhẵn; vòi
nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh. Đĩa mật có thùy trước cao hơn các thùy khác. Quả
hạch nhỏ, gần hình cầu, đường kính 1-1,5 mm, có gân mạng lưới, màu nâu
đậm hoặc vàng nâu [5, 12].
Trên thế giới, Tía tô phân bố ở Ấn Độ, Butan, Myanmar, Trung Quốc,
Triều Tiên, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Indonesia [5,
12].
3

Theo Thực vật chí Trung Quốc, loài Perilla frutescens L. Britton gồm 3
thứ được phân loại theo khóa sau:
1a. Lá có răng cưa sâu, hẹp, màu tím
…. var. crispa
1b. Lá có răng cưa thô, đôi khi có màu xanh, ít nhất là
ở mặt trên

2a. Đài quả tới 1,1cm, đế và thân có lông dài,

(tương tự thứ Perilla frutescens var. crispa trong thực vật chí Trung Quốc)
Tên đồng nghĩa: Perilla ocymoides L. var. crispa Benth, Ocimum
crispum Thunb., Perilla frutescens var. crispa (Thunb.) Hand Mazz,
Dentidia nankinensis Lour., Plectranthus nankinensis Spreng., Perilla
nankinensis (lour) Decne.
Khác với thứ chuẩn đã mô tả ở trên bởi thân gần như nhẵn hay chỉ có
lông rải rác ở phần non; lá màu tím, xẻ răng cưa sâu, rúm và thường biến thái
hơn; đài quả cũng có kích thước nhỏ hơn.
Thứ này được phân bố rộng rãi hầu khắp các tỉnh, thành phố ở nước ta.
Trên thế giới, chúng còn được trồng ở Trung Quốc, Nhật Bản [5].
1.1.3. Đặc điểm sinh thái
Cây trồng bằng hạt và được gieo trồng vào tháng 5 [26]. Mùa hoa vào
tháng 7-9, mùa quả vào tháng 10-12. Cây ưa sáng và ẩm, thích hợp với đất
thịt và đất phù sa [5].
1.1.4. Bộ phận dùng
Hạt cây Tía tô chứa dầu béo, dùng để rang ăn. Ngọn và lá non dùng
làm rau gia vị và làm thuốc. Cây có tinh dầu. Toàn cây được dùng làm thuốc
[5, 25].
5

1.2. Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) và trình tự di truyền
đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô
1.2.1. Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding)
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada đã đề xuất "Mã vạch DNA" (DNA Barcoding) như là một cách để xác
định loài. Phương pháp mã vạch sử dụng một đoạn trình tự gen rất ngắn lấy
từ một vị trí chuẩn của hệ gen. Cách dùng giống như cách một máy quét ở
siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách phân biệt các mã vạch màu
đen đặc trưng cho từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mẫu
trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, nhưng

độ dài vùng phiên mã nội ITS có sự khác nhau: ITS1 (187bp đến 298 bp) và
ITS2 (187 bp đến 252 bp). Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới
700 bp [14, 15].

Hình 1.1: Cấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng
Có 4 lý do để ITS ngày càng trở nên phổ biến: (i) Tính sẵn có của một
số bộ mồi PCR phổ biến (hoặc tương tự) áp dụng với một lượng lớn của các
nhóm loài. (ii) cấu trúc đa sao chép tạo điều kiện khuếch đại PCR thậm chí từ
mẫu tiêu bản. (iii) Các kích thước vừa phải của ITS (dưới 700 bp) thường cho
7

phép khuếch đại và giải trình tự mà không cần nội mồi, ngoại lệ với nhiều
nhóm thực vật hạt trần. (iv) Do mức độ của sự biến đổi, ITS thường cung cấp
đủ các marker phân tử thích hợp cho các nghiên cứu tiến hóa ở cấp độ loài,
như nguồn gốc của các loài đa bội, lai tạo, biến đổi gen, và cuối cùng, suy
luận phát sinh loài [15, 22].
Với cây Tía tô, trên thế giới có rất nhiều công bố về trình tự đoạn DNA
ribosom nhân vùng phiên mã nội (rDNA – ITS1-5.8S-ITS2). Các đoạn trình
tự này đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới Genbank [38]. Đây là cơ
sở của việc nghiên cứu xác định đoạn trình tự của mẫu nghiên cứu ở Việt
Nam và so sánh với các trình tự đã so sánh trên thế giới.

1.3. Thành phần dầu hạt Tía tô
Dầu thu được từ hạt thường có màu vàng nhẹ, trong suốt và có mùi
thơm, tan nhẹ trong ethanol [8, 9]. Thành phần dầu chiếm khoảng 35-45%
khối lượng hạt. Dầu trong hạt Tía tô có thành phần chủ yếu là triacylglycerol
được cấu tạo bởi glycerol và các acid béo. Acid béo trong dầu hạt Tía tô chủ
yếu là acid béo không no, và một phần acid béo no[8]. Ngoài ra, dầu hạt Tía
tô còn chứa các polyphenol, flavone khác nhau (rosemarinic acid, luteolin,
chrysoeriol, quercetin, catcehin, apegenin và shishonin) [8], và các hợp chất


Các phương pháp chiết tách dầu từ hạt Tía tô là phương pháp ép [31,
35] và phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ [11, 30]. Tuy nhiên, phương
pháp chiết bằng dung môi thường được làm trong phòng thí nghiệm với quy
mô nhỏ. Khi sản xuất tạo ra sản phẩm trên thị trường, phương pháp ép thường
được sử dụng, để tránh sự có mặt của các dung môi độc hại trong dầu [31].
Phương pháp phân tích thành phần các acid béo trong dầu mỡ động
thực vật được áp dụng phổ biến nhất hiện nay là phương pháp Sắc ký khí dịch
chiết thủy phân chất béo dựa trên các quy trình chuẩn như AOAC [6], LGC,
FAPAS [10, 18, 30].
Ngoài ra, có một số phương pháp khác được thực hiện trong một số
nghiên cứu về hàm lượng omega-3 trong thực phẩm. Năm 2011, Ian Acworth
và cộng sự đã nghiên cứu ra quy trình định lượng các acid béo omega-3,
omega-6 trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC pha đảo và phát hiện
bằng detector aerosol tích điện [7].
1.3.2. Vitamin E
Vitamin E được biết tới là một chất chống oxy hóa tốt có cấu tạo gồm 4
dạng cấu hình (α, β, δ, γ) của 2 nhóm Tocopherol và Tocotrienol. Kết quả
nghiên cứu gần đây cho thấy, α-Tocotrienol có tác dụng chống lại các tác
nhân oxy hóa tự do gấp 3 lần so với α-Tocopherol trong thử nghiệm in vitro.
Các Tocotrienol cũng được báo cáo là ức chế quá trình tổng hợp cholesterol,
làm giảm nồng độ cholesterol huyết tương trong các thí nghiệm trên động vật,
và ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư, trong đó, tác dụng của cấu hình γ,
δ, được chứng minh là có hiệu lực tốt hơn cấu hình α [17].
Cũng giống như các dầu thực vật khác, vitamin E trong dầu hạt Tía tô
thường tồn tại ở dạng đồng phân chính là γ-tocopherol. Trong nghiên cứu của
Ozan Nazim Ciftci và cộng sự (2012), tổng hàm lượng của vitamin E là 734
mg/kg, hàm lượng của đồng phân γ-tocopherol là 691 mg/kg (chiếm 94,1%
10


Khi gia tăng tỷ lệ omega-3 (tức là giảm tỷ lệ omega-6:omega-3) thì tạo ra các
tác dụng ngược lại. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong chế độ ăn, tỷ lệ omega-
6: omega-3 cần được cân bằng trong khoảng 4:1 đến 1:1 [27].
1.4.1. Tác dụng trên hệ hô hấp
Năm 2000, Okamoto và cộng sự đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của
dầu hạt Tía tô (giàu omega-3) trên bệnh nhân hen phế quản về chức năng hô
hấp của phổi và sự tạo thành leukotrien B4 (LTB4) và LTC4 bởi bạch cầu.
Kết quả cho thấy dầu hạt Tía tô có tác dụng điều trị bệnh hen vì làm giảm
hoạt động của LTB4 và LTC4 sinh ra bởi bạch cầu và cải thiện chức năng hô
hấp [21].
1.4.2. Tác dụng trên hệ tim mạch
Năm 1999, Ezaki và cộng sự đã làm thử nghiệm lâm sàng về ảnh
hưởng của việc sử dụng dầu hạt Tía tô giàu omega-3 trên 20 người cao tuổi ở
Nhật Bản trong vòng 3 tháng để đánh giá yếu tố nguy cơ trên bệnh mạch vành
và nồng độ acid béo trong huyết tương. Kết quả cho thấy nồng độ acid α-
linolenic (ALA, acid béo omega-3) trong huyết tương tăng từ 0.8% đến 1.6%,
nồng độ acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexanoic (DHA) tăng
tương ứng là 2.5-3.6% và 5.3-6.4% [21]. Sự gia tăng các chất ALA, EPA và
DHA trong huyết tương có thể ngăn ngừa các bệnh mạch vành và giảm cục
máu đông [21, 23].
1.4.3. Tác dụng chống viêm
Dầu hạt Tía tô giàu acid α-linolenic (ALA), làm giảm hoạt động của
AA trên màng tế bào, ức chế sự chuyển hóa của AA, giảm sản sinh cytokines
IL-1β và TNFα bởi các đơn bào được kích thích in vitro, tương tự như trong
các bệnh viêm [8, 27].
12

1.4.4. Tác dụng trên não bộ
Liều cao omega-3 trong dầu Tía tô được sử dụng cho nhóm thí nghiệm
có tác dụng ngăn chặn hoàn toàn nhiễm độc thần kinh gây ra bởi dopamine.

• Nitơ lỏng
• Bộ kit chiết tách DNA thực vật GeneJET – số lô 00209197 (Thermo
Scientific).
• Bộ kit tinh sạch DNA GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
• Bộ kit giải trình tự DNA BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kits (Applied Biosystems).
• Dung dịch đệm TAE 1x: pha từ dung dịch gốc TAE 10x có thành phần
như sau: 48.4 g Tris base (Sigma); 11.4 mL glacial acetic acid (17.4M)
(Sigma); 3.7g EDTA disodium salt (Sigma), pha trong nước khử ion vừa đủ
1L.
14

• Gel agarose 1%: 0,5g agarose pha trong 50mL đệm TAE 1x, đung
trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn tạo dung dịch trong suốt (khoảng 2 phút).
Để nguội đến khoảng 60˚C, thêm 2 µL ethidium bromide (EB): 10 mg/mL
(Sigma) rồi đổ ra khay đã có lược để tạo giếng. Để thạch nguội ở nhiệt độ
phòng.
• Thang DNA 100 bp chuẩn (Ladder 100bp) (Thermo Scientific)
• Cặp mồi: ITS1-ITS4 (Intergrated DNA Technologies) :
Mồi xuôi: ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)
Mồi ngược: ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
2.1.3. Máy móc, thiết bị
2.1.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu
• Kính lúp soi nổi Leica EZ4, kính hiển vi Leica CME.
• Máy ảnh kỹ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, kim mũi mác, dao,…
2.1.3.2. Nghiên cứu đặc điểm di truyền
• Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu -22˚C (Biomedical Freezer – Sanyo)
• Dụng cụ tách chiết DNA từ mẫu: chày, cối, kéo, máy votex IKA, máy
ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu, ống eppendorf (2,0
mL, 1,5 mL), bể ổn định nhiệt Memmert WNB10, micropipette (1000, 100,

Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới. Thêm 400 µL Plant
DNA Binding Solution và 400 µL ethanol 96% và trộn đều.
#7. Chuyển hỗn hợp trên vào một ống spin column được cung cấp sẵn. Ly
tâm với tốc độ vòng 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
#8. Thêm 500 µL Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin
column. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch nổi.
Column chuyển sang, đặt trong ống eppendorf mới.
16

#9. Thêm 500 µL Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96%. Ly tâm với tốc
độ 13.200 vòng/phút trong 6 phút. Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi.
Colunm chứa DNA được chuyển sang đặt trong eppendorf mới.
#10. Thêm 100 µL Elution Buffer để hòa tan DNA, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng. Sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại column,
thu ống eppendorf có chứa DNA đã được hòa tan.
#11. Kiểm tra quá trình chiết DNA trên bản gel agarose 1%.
#12. Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20˚C để thực hiện các bước tiếp theo.
2.2.3.2. Khuếch đại DNA (PCR)
Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày
trong bảng dưới đây.
Bảng 2.1. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích (µL)/ 1
phản ứng
Thể tích (µL)/ mẫu
thí nghiệm
Nước khử ion vô trùng
5,10
25,5
Dung dịch đệm cho Taq DNA