TRƯ
NGHIÊN C
THÀNH PH
TÍNH C
(
ARCANGELISIA FLAVA
KHÓA LU
BỘ Y TẾ
TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N
ỘILÊ TÙNG SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PH
ẦN HÓA HỌC V
À Đ
TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN
ARCANGELISIA FLAVA

(L.) MERR

KHÓA LU
ẬN TỐT NGHIỆP DƯ
ỢC


Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người
thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian va tâm huyết tận tình giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Dược sĩ Đỗ Phương Lan, người
hướng dẫn, người thầy thứ hai, đã theo sát tôi trong tiến trình, giúp tôi vượt qua khó
khăn, bỡ ngỡ.
Tôi cũng rất cảm ơn Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết
lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Bạn Nguyễn Thị Lương – A2K65, bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, dược sĩ
Nguyễn Thị Thùy Linh, đã sát cánh cùng tôi, luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình
làm khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, các giảng
viên trong trường đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình rèn
luyện, học tập tại trường.
Cuối cùng xin được gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình người thân đã tạo
quan tâm chăm sóc, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Tùng Sơn


3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT …20
3.1.1. Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu 20
3.1.2. Giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 21
3.1.3. Đặc điểm vi học bột dược liệu 21
3.1.4. Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá 22
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 25
3.2.1. Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học 25
3.2.2. Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng 27
3.2.3. Bán định lượng berberin trong alcaloid toàn phần của AR7 29
3.3. Kết quả thử độc tính trên chuột nhắt trắng 35
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37
4.1 Về thực vật 37
4.2. Về thành phần hóa học 37
4.3. Về thử độc tính cấp trên chuột 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM
KHẢO Error! Bookmark
not defined.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADC Analog-to-digital converter
BR Berberin
DD Dung dịch
HPTLC High performance thin layer chromatography

LDL Low-density lipoprotein
PƯ Phản ứng
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TLC Thin layer chromatography

Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml).
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu.
Bảng 3.2. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn
Bảng 3.3. Kết quả sắc ký đồ các dịch chiết alcaloid toàn phần ở hệ 4 ở bước sóng
366nm.
Bảng 3.4. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn.
Bảng 3.5. Khảo sát độ pha loãng của dung dịch thử.
Bảng 3.6. Kết quả bán định lượng berberin ở mẫu AR7 ở độ pha loãng 400 lần
Bảng 3.7. Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ
Bảng 3.8. Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực vật bậc
cao, được sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền thống. Ngoài các tác dụng
thường được biết đến như tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp,
v.v, ngày nay y học hiện đại đã phát hiện thêm các tác dụng mới của berberin như
điều trị ung thư, tiểu đường, v.v[2], [17], [33].
Trên thế giới đã xác định được 150 loài có chứa berberin thuộc 23 chi và 7
họ[7]. Ở Việt Nam đã xác định được các chi cho berberin gồm Coscinium, Cyclea
(Menispermaceae), Berberis, Podophyllum, Mahonia (Berberidaceae), Euodia,
Toddalia (Rutaceae), Coptis, Thalictrum (Ranunculaceae) và một số chi họ
Papaveraceae. Tuy nhiên việc khai thác tràn lan đã khiến các nguồn dược liệu chứa
berberin ngày càng trở nên khan hiếm và có nguy cơ cạn kiệt.
Cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae)
là một loài cây được đồng bào dân tộc sử dụng nhiều làm thuốc chữa bệnh. Trên thực
tế, qua điều tra tại thực địa, nghiên cứu nhận thấy đây là một nguồn dược liệu chứa
berberin quý hiếm.

noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc. Quả hạch có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng
–trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt ngoài có lông. Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong
cứng. Hạt có nhiều phôi nhũ quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [8], [34].
1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam
1.1.3.1. Arcangelisia loureiri(Pierre) Diels– Vẩy đắng, Dây hoàng liên, Cổ sơn
long
Dây leo to hóa gỗ, cành già có khía. Lá đơn, mọc so le, hình trứng tròn hoặc
hình bầu dục rộng, dài 8-12 cm, rộng 6-10cm, đầu nhọn, gốc gần bằng ngang; gân
gốc 3-5; cuống lá phình ở gốc và ở ngọn, dài 3-8 cm. Cụm hoa chùm, ở nách lá trên
các nhánh già. Cụm hoa đực nhỏ, dài 8cm, phân nhánh hình bông, không cuống, lá
bắc hình tam giác; lá đài ngoài 3, 3 gần hình thuyền; nhị 9 hướng ngoài, rất ngắn.
3

Cụm hoa cái dài 30-50cm. Hoa cái có 6 phiến bao hoa, hình tròn dài hẹp, đầu mút
hướng ra sau; nhị thoái hóa nhỏ, dạng vẩy; lá noãn 3; không có vòi nhụy; đầu nhụy
rộng, có 3 góc.Quả hạch hình tròn dài, về sau có màu vàng, ở đỉnh có dấu vết của đầu
nhụy, mặt ngoài có lông mềm.
Phân bố ở Malaysia, Indonesia(Sumatra), Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở
nước ta cũng chỉ gặp tại tỉnh Đồng Nai (Bảo Chang, Cát Tiên) [8].
1.1.3.2. Arcangelisa flava (L.) Merr – Dây Hoàng Liên, Cổ An
Dây leo to; gỗ vàng tươi, mủ vàng; nhánh non không lông, đen, cũng như
cuống lá. Phiến to hay trung, kích thước 10-25 x 4,5-19cm, dai cứng, không lông,
gốc tròn hay hình tim, gân 5 từ gốc; cuống 3-15cm, phù 2 đầu. Chùm tụ tán 10-50cm;
hoa đực nhỏ, 3 lá đài ngoài, 3-3 lá đài trong, tiểu nhụy lép như vảy, 3 tâm bì. Trái
xoan, dài 2 cm, vàng, trên đế hoa phù rộng.
Phân bố: Loài phân bố ở Thái Lan, Việt Nam và Nam Trung Quốc, ở nước ta
chỉ gặp ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai. Thu hái quanh năm, rửa sạch, thái lát, phơi khô
[9].
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Theo nghiên cứu của Thornber (1970), alcaloid nhân isoquinolin gồm

Các thử nghiệm sinh học bằng cất phân đoạn dịch chiết nóng từ thân cây đã
giúp phân lập palmatin, berberin, jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-hydroxyecdyson
từ Arcangelisia flava (L.) Merr.trong đó 3 chất đầu tiên đã được biết đến là thành
phần của Arcangelisa flava (L.) Merr.còn jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-
hydroxyecdyson là những sản phẩm tự nhiên được phân lập lần đầu tiên[24].

Hình 1.3.Công thức hóa học của dihydroberberin (4) và 20-hydroxyecdyson (5)
6

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC
Dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L.) Merr.cho tác dụng chống oxi
hóa trung bình với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ở liều EC
50
là
25-55µg/ml. Dịch chiết methanol, chloroformcho tác dụng gây độc tế bào đối với
tôm mặn (brine shrimp) và dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với liều LC
50
và IC
50
giá
trị lần lượt là 210-278 và 8-12µg/ml [20].
Hoạt tính kháng khuẩn của Arcangelisia flava (L.)Merr. được đánh giá thông
qua phương pháp khuếch tán đĩa với dịch chiết nước của Arcangelisia flava
(L.)Merr., sử dụng 3 vi sinh vật:Salmonella typhii, Staphylococcus aureus và
Trichophyton rubrum. Kết quả, cho hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt với 3 chủng vi sinh
vật trên[18]. Đối với Aeromonas hydrophila, cũng bằng phương pháp khuếch tán đĩa
trong môi trường thạch, trong các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether,
methanol, aceton và nước từ thì dịch chiết Chloroform của Arcangelisia flava
(L.)Merr.cho hoạt tính kháng cao nhất với vòng ức chế đường kính 17,25mm [23].
Năm hợp chất furanoditerpen được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr.

1.5. SƠ LƯ
ỢC VỀ BERBERIN
1.5.1
.
Công th
ức hóa học v
Công thức phân tử: C
20
Công thưc hóa học:
Tên khoa học:5,6
dihydro
anthracen clorid dihydrat
Lý tính:
Tinh thể hay b
ột kết tinh m
dạng base là 145
o
C (b
ị phân hủy).
ethanol, khó tan trong eth
trong nư
ớc sôi, tan trong
mu
ối sulfat dễ tan trong n
đối nên không có đ
ồng phân quang học
7
cây đư
ợc dùng để lợi tiêu hóa, bổ huyế
t, làm

[6].
ột kết tinh m
àu vàng, không mùi, có v
ị rất đắng. Độ chảy khi ở
ị phân hủy).
D
ạng base tan chậm trong n
ethanol, khó tan trong eth
er. D
ạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong n
ớc sôi, tan trong
ethanol, th
ực tế không tan trong chloroform v
ối sulfat dễ tan trong n
ư
ớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất
ồng phân quang học
[15].
t, làm
thuốc điều kinh
t rét, b
ệnh lỵ, sốt và được
ị
đắng, tính bình, hơi
t, giúp ho, ch
ống bướu [9],
ư
ợng: 407,9.

azoniaindeno(5,6

huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và sau đó thì hạ. Berberin đem khử hóa cho
tetrahydroberberin có tác dụng an thần và mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3].
Berberin gần đây đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về tác dụng hạ
đường huyết và cho thấy hiệu quả tương đường với metformin, cơ chế hoạt động bao
gồm việc ức chế aldose reductase, làm giảm đường và ngăn ngừa sự kháng insulin.
Berberin làm giảm mạnh lượng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid và xơ vữa
9

nhưng cơ chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác dụng
phụ điển hình như statin [29].
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tác dụng chống ung thư của berberin, berberin
có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm ung thư vú,
ung thư biểu mô, ung thư tụy, ung thư dạ dày mà không làm ảnh hưởng đến sự phát
triển của các tế bào bình thường ở nồng độ nhất định [26].
1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ
thuật SKLM. Thiết bị HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như:
máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký
(ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC
Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [35].
Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng
thông thường. Cả hai phương pháp đềulà kỹ thuật tách được tiến hành trên một lớp
mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh
làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha đng
bao gm dung dch cn phân tích đc hòa tan trong mt dung môi thích hp
và đc hút lên bn sc kí bi lc mao dn, (hoc đa lên bn mng bng lc
đy ca máy), tách dung dch thí nghim da trên tính phân ccca các thành
phn trong dung dch [1].

lớp mỏng) được mô tả trong bảng 1.1.

11

Bảng 1.1: So sánh một số tham số của HPTLC và TLC
TT Tham số HPTLC TLC
1 Công nghệ Bán tự động Thủ công
2
Độ dày lớp pha tĩnh 5-6µg 10-12µg
3
Chiều cao đĩa lý thuyết 12µg 30µg
4
Hiệu lực tách Cao Thấp hơn
5
Giới hạn phát hiện(Sử dụng
máy đo độ hấp thụ UV-VIS)
100-500pg 1-5 ng
6 Giới hạn phát hiện(Sử dụng
máy quét huỳnh quang)
5-10pg 50-100ng
Ưu điểm của HPTLC so với TLC như sau [10]:
- Khả năng phân tách tốt hơn. Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng
cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản
mỏng cũng tốt hơn.
- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản
mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn.
- Thời gian triển khai ngắn hơn.
- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển
khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các yếu tố về
môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn

bản
HNIP/18120/15

HNIP/18121/15

HNIP/18122/15

Mẫu nghiên cứu thực vật được lấy cả thân, lá và cơ quan sinh sản (nếu có),
tiêu bản cây khô được lưu tại phòng Tiêu bản – Bộ môn Thực vật – Trường Đại học
Dược Hà Nội.
Mẫu nghiên cứu hoá học và tác dụng sinh học được lấy phần thân, được thái
nhỏ, sấy khô ở 55-60
o
C, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.
13

2.1.1.2. Hóa chất, vật liệu
Berberin clorid và palmatin clorid chuẩn: Viện kiểm nghiệm, tiêu chuẩn
phòng thí nghiệm.
Dung môi: n-butanol, acid acetic, cloroform, methanol, n-propanol, acid
formic, ethyl acetat, toluen, amoniac, nước cất, EtOH 90%, EtOH 25%, ether.
Các hóa chất và thuốc thử định tính: Bột Magie kim loại, dd HCl đặc, dd NH
3

đặc, dd NH
3
6N, dd NaOH 10%, dd FeCl
3
5%, dd NaOH đặc, dd acid sulfanilic, dd
NaNO

Giấy quỳ, ống mao quản, bản mỏng, ống lưu mẫu, hạt silicagel, bản mỏng
TLC, giấy bóng bọc, giấy dán nhãn.
2.1.1.3. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, khỏe mạnh, giống cái,
do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.
2.1.2. Thiết bị
- Hệ thống chiết xuất: Bình cầu, ống sinh hàn, dây nối.
- Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
- Kính lúp soi nổi Nikon ECLIPSE.
- Máy HPTLC Camag bao gồm : thiết bị chấm mẫu Linomat 5, thiết bị khai triển ADC
2, máy soi UV-visualizer.
- Bộ dụng cụ hồi lưu cách thủy: Sinh hàn, giá đỡ kim loại, bình chiết hồi lưu, ống cao
su, bếp đun hồng ngoại.
- Bình chiết hồi lưu.
- Bình triển khai sắc ký.
- Nồi đun cách thủy.
14

- Tủ sấy WiseVen ® WOF.
- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60.
- Cân phân tích Shimadzu.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 50, 100 và 200 ml; bình định mức 5 ml, 10 ml, 25
ml, 50 ml, 100 ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Về thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu.
- Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
- Làm tiêu bản vi phẫu thân, mô tả, quan sát đặc điểm cấu tạo giải phẫu.
- Quan sát, mô tả đặc điểm bột dược liệu.
2.2.2. Về thành phần hoá học

Cân chính xác khoảng 1,0g bột dược liệu. Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi
methanol: acid hydroclorid (100:1). Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết.
Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100:1), chiết lặp lại 2
lần. Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn. Hòa tan trong nước nóng 5
lần, mỗi lần 15ml, lọc lấy dịch chiết. Cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn trong
methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch lắc đều,
lọc qua màng lọc 0,45 µm.
(2) Tiến hành sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị bản mỏng: Dùng bản mỏng Aluminum silicagel GF
254
, hoạt hóa bản
mỏng ở 110
o
C trong 1 giờ, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.
16

Chuẩn bị pha động: Khảo sát các hệ pha động sau để chọn ra hệ có khả năng
tách tốt nhất để tiến hành định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng.
- Hệ 1: n-butanol: acid acetic: H
2
O (7: 1:20) [6].
- Hệ 2: Chloroform: methanol (9:1)[22].
- Hệ 3: n-propanol:nước:acid forrmic(90:8:0,4)[12].
- Hệ 4: Ethylacetat:n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1,0:2,0)[19], [22].
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch berberin chuẩn và palmatin chuẩn dùng
để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu là dung dịch có nồng độ 0,06%.
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Là dịch chiết alcaloid toàn phần.
(3) Phát hiện vết trên sắc ký đồ
Quan sát bản mỏng đã triển khai bằng cách soi đèn tử ngoại trong thiết bị
TLC-visualizer ở bước sóng 366nm, 254nm. Chụp ảnh kết quả thu được.

C trong 1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
(5) Hệ dung môi khai triển: ethylacetat: n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1:2).
(6) Tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên hệ thống HPTLC Camag: sử dụng
phần mềm Wincat.
+ Phun mẫu bằng máy Linomat 5, thể tích phun mẫu là 3 µl, độ dài vết 6mm, vị trí
chấm cao 0.8mm, cách mép 1.5mm.
+ Triển khai sắc ký trên máy ADC 2 trong điều kiện:
Thể tích dung môi dùng để bão hòa là 25ml, thời gian bão hòa dung môi là 20
phút. Thể tích dung môi dùng để triển khai sắc ký là 10 ml. Chiều dài quãng đường
chạy của dung môi là 80 mm. Thời gian làm khô dung môi sau khi triển khai là 5
phút.
+ Quan sát bản mỏng dưới đèn UV ở bước sóng 254nm và 366nm.

Trích đoạn Về thử độc tính cấp trên chuột

---