BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
VITAMIN B
1
, B
2
, B
6
, B
9
TRONG SẢN
PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC
CHO TRẺ EM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ


LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn
thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình
với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất
và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng,
những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thanh Nga, cô
Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ
khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ
tôi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,
các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc
Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn động
viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm
nay. Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Cúc

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ. 13
2.1.1. Nguyên vật liệu. 13
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc. 13
2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 14
2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
,
B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC. 14
2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. 14
2.2.3. Ứng dụng. 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 15
2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
,
B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng

3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký. 42
3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B
1
, B
2
, B
6
, B
9
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ
EM TRÊN THỊ TRƢỜNG. 43
BÀN LUẬN 47
KẾT LUẬN 48
ĐỀ XUẤT 51
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC
Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
LOD:
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ:
Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification)
MeOH:

trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC.
6
3.1
Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình
20
3.2
Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau
21
3.3
Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau
23
3.4
Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau
23
3.5
Ba chƣơng trình gradient khảo sát
25
3.6
Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
31
3.7
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9


Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin
B
2
, B
6
, B
9

42
3.15
Kết quả độ ổn định của các vitamin
43
3.16
Hàm lƣợng vitamin B
1
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng
công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
44
3.17
Hàm lƣợng vitamin B
2
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng
công thức cho trẻ em trên thị trƣờng
44 3.18
Hàm lƣợng vitamin B
6
trong một số sản phẩm dinh dƣỡng

3.1
Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm)
24
3.2
Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm)
25
3.3
Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bƣớc sóng 267nm của
3 chƣơng trình gradient
26
3.4
Phổ hấp thụ UV của các vitamin
28
3.5
Sắc ký đồ mẫu trắng tại bƣớc sóng 246nm (đánh giá tính
chọn lọc)
32
3.6
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bƣớc sóng 246nm.
33
3.7
Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bƣớc
sóng 246nm
33
3.8
Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ của các vitamin B
1
, B
2

công thức sữa, bột dinh dƣỡng hoặc thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn
hợp các vitamin. Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho
trẻ nhỏ. Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các
sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng cũng nhƣ phƣơng
pháp phân tích các chất dinh dƣỡng, bao gồm các vitamin nhóm B. Việc xác định
chính xác hàm lƣợng các vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo
quyền lợi và sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm và phục
vụ các nghiên cứu dinh dƣỡng chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong
sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC” với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm
B gồm B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ
em bằng phƣơng pháp HPLC.

2
, B
6
, B
9
.
1.1.1.1. Công thức cấu tạo, công thức phân tử [6], [9], [35], [37].

Hình 1.1: Vitamin B
1
Hình 1.2: Vitamin B
2
Hình 1.3: Vitamin B
6
Hình 1.4: Vitamin B
9

1.1.1.2. Tính chất và tác dụng.
 Vitamin B
1
(Thiamin hydroclorid).
3

- Tính chất: Thiamin dạng base không ổn định vì có cấu trúc nitơ bậc 4 nên B
1

thƣờng đƣợc bào chế dạng muối hydrochlorid hoặc mononitrat, hai dạng muối

 Vitamin B
6
(Pyridoxin hydroclorid).
- Tính chất: Vitamin B
6
là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở
vị trí nhóm chức số 4: pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin. Dạng pyridoxin
hydroclorid thƣờng đƣợc dùng trong thực phẩm dinh dƣỡng công thức.
Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng,
bền vững trong không khí, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong ethanol
(1g/90ml), không tan trong ether, cloroform [6], [9]. Ổn định trong môi trƣờng
nƣớc với pH từ 2-4,5; hấp thụ mạnh bức xạ UV [9].
4

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B
6
, biểu hiện:
tổn thƣơng mắt, mũi, miệng, co giật, thiếu máu. Phòng và điều trị một số bệnh ở
hệ thần kinh do các thuốc khác (isoniazid) gây ra [8].
 Vitamin B
9

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng cam, thực tế không tan trong
nƣớc và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong các dung dịch acid và kiềm
loãng [6], [9], [35]. Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử,
acid, kiềm và khi bị đun nóng. Dung dịch trong nƣớc kém bền trong môi
trƣờng pH dƣới 6 [9].
- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B
9
(thiếu máu

hiện nay là phƣơng pháp vi sinh [25],
[26], [27]. Phƣơng pháp sắc ký cũng ngày càng phát triển nhƣ tiêu chuẩn AOAC
2004.07 phân tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức trẻ em [30].
Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS)
cũng đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin nhƣ vitamin B5 vì
tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp
[28].
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phƣơng pháp phân
tích đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm. Một số nghiên cứu dùng
5

phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm [40],
[38]; phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [33], [39], [34], [22].
Một số quy trình xử lý mẫu dùng để định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B
trong chế phẩm dinh dƣỡng công thức:
Quy trình 1: Joon Hyuk Suh và cộng sự [34]:
Cân chính xác 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 15ml

Thêm 2ml nƣớc cất, lắc đều, lắc xoáy 3 phút ở nhiệt độ phòng

Thêm 6 ml acetonitrile, lắc đều

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

Hút lấy dịch trong, thổi khô dung môi bằng khí nitơ

Hòa tan phần còn lại trong 5ml nƣớc cất

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC


LOQ, LOD
[33]
Bột dinh
dƣỡng trẻ
em
B
5
, B
8
,
B
9
, B
12

Methotrexate,
dung dịch
amoni axetat,
chloroform
- Rửa giải gradient: Gồm
acetonitrile và nƣớc có
chứa 0,1% axit formic
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Cột Acquity
UPLC Ben C18
(2,1 mm × 100
mm, 1,7μm)
- Nhiệt độ cột:
35°C
UPLC MS-MS

- LOQ (µg/L):
B
5
: 0,016
B
8
: 0,090
B
9
: 0,020
B
12
: 0,019
[39]
Thịt sau
khi nấu
B
1
, B
6
,
B
12

TCA
- Pha A: octanesulfonic
axit 5 mM, trietylamine
0,5%, axit acetic 2,4%
và MeOH 15%
- Pha B: acetonitrile 100%.

B
1
, B
2
,
B
3
, B
5
,
B
6
, B
9

Nƣớc và
acetonitrile
- Rửa giải gradient:
A: 20 mM kali
phosphate pH 3.0
B: 50% acetonitrile (v/v)
trong 20 mM kali
phosphate pH 3,0
- Tốc độ dòng chảy giữa
0,8 và 1,0mL / phút.
- Develosil
RPAQUEOUS
C30 (4,6 mm ×
250 mm, 5 µm)
- Nhiệt độ cột:

trẻ sơ sinh
(lỏng, bột)
B
1
, B
2
,
B
3
, B
6
,
B
9
, B
12

TCA, nƣớc
- Gồm 5 mM acid
octanesulfonic; 0,5%
trietylamine; 2,4%
glacial acetic acid và
MeOH 15%.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Cột Tracer
Spherisorb ODS-
2 C
18
(250x 4,6
mm, 5 µm)

thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin. Một số
tiêu chuẩn dùng phƣơng pháp HPLC để phân tích vitamin B
1
[21] , B
2
[18]; phƣơng
pháp vi sinh hoặc HPLC với B
6
[19], [17]; phƣơng pháp vi sinh với B
9
[20]. Hiện
nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản
phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định phƣơng pháp phân tích riêng từng
vitamin nhóm B – áp dụng các phƣơng pháp của AOAC.
Việc nghiên cứu định lƣợng đồng thời nhiều vitamin nhóm B cũng đã phát triển
trong những năm gần đây nhƣng đó hầu hết là các nghiên cứu trên đối tƣợng dƣợc
phẩm [1], [14], [15]; nghiên cứu trên đối tƣợng thực phẩm còn rất ít. Tác giả Phạm
Thị Thanh Hà và cộng sự [12] đã định lƣợng đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
, C,
PP trong cốm dinh dƣỡng bằng phƣơng pháp điện di mao quản.
Phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm
đƣợc ứng dụng trong phân tích vô cơ, hữu cơ, môi trƣờng, dƣợc phẩm, nhƣng yêu
cầu sử dụng các thuật toán phức tạp, cần có máy tính và phần mềm chuyên dụng.

5
),
pha động là những dung môi phân cực (nƣớc, methol, acetonitril,…), thứ tự rửa giải
là các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên [2], [10], [11], [13].
1.2.2. Các thông số đặc trƣng.
1.2.2.1. Thời gian lưu.
Thời gian lƣu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân
tích xuất hiện đỉnh pic trên sắc ký đồ.
Với một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì
vậy có thể dùng thời gian lƣu để định tính các chất.
1.2.2.2. Hệ số phân bố K.
Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha
tĩnh.






Với: C
S
: nồng độ mol chất phân tích trong pha tĩnh.
C
M
: nồng độ mol chất phân tích trong pha động.
K phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và bản chất hai pha. Trị số K càng lớn,
sự di chuyển của chất phân tích qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ [10].

Đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B ta dùng hệ số chọn lọc
α:










 



 


Với k’
B
>k’
A
.

Tối ƣu với 1,5 < α < 2 [2], [10], [13].
1.2.2.5. Hệ số đối xứng F.
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng F:



.
R
S
đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha.





 




 






 




 


Với: t

cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử
dụng phƣơng pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nộng độ mẫu
chuẩn. Nồng độ của mẫu thử đƣợc tính theo công thức: 








C
X
, C
S
: Nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn.
S
X
, S
S
: Diện tích của pic mẫu thử, mẫu chuẩn.
 Chuẩn hóa nhiều điểm:
Cách tiến hành: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ tăng dần
rồi tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc
chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn C. Sử dụng khoảng tuyến tính của
đƣờng chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phƣơng trình hồi
quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chất
cần xác định:  



CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ.
2.1.1. Nguyên vật liệu.
- Chất chuẩn:
 Thiamine hydrochloride C
12
H
17
ClN
4
OS.HCl: hàm lƣợng 100%, độ ẩm
3,5%, CAS number 67-03-8, hãng Sigma-aldrich.
 Riboflavin C
17
H
20
N
4
O
6
: hàm lƣợng 99,9%, CAS number 83-88-5, hãng
Sigma-aldrich.
 Pyridoxine hydrochlororide C
8
H
11
NO
3
.HCl: hàm lƣợng 99,64%, CAS

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120g) (Đức)
- Ống nghiệm thủy tinh 15ml, ống ly tâm 50ml.
- Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, pipetman, cốc có mỏ,….
14

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu QC do công ty Abbott cung cấp.
- Mẫu nghiên cứu: Sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em (bột dinh
dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
, B
2
,
B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC.
 Quy trình xử lý mẫu: Khảo sát một số quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời
các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B


 Độ thu hồi.
2.2.3. Ứng dụng.
Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
trong một số sản phẩm
dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B
1
, B
2
,
B
6
, B
9
trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng
phƣơng pháp HPLC.
2.3.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu.
Chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình xử lý mẫu đƣợc xây dựng dựa trên
hai quy trình của Joon Hyuk Suh cùng cộng sự [34] và của Soledad Albalá-Hurtado
cùng cộng sự [22].
Với quy trình đã chọn, tiếp tục khảo sát các yếu tố: thể tích TCA 20%, cách lắc,

16

 Mẫu trắng
 Mẫu chuẩn hỗn hợp các vitamin B
1
, B
2
, B
6
, B
9
.
 Mẫu thử
- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu đƣợc.
- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu đƣợc, tại thời điểm xuất hiện pic
của các vitamin không đƣợc xuất hiện pic lạ.
2.3.2.3. Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin có nồng độ tăng dần. Tiến
hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.
- Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và 0,995 ≤ r ≤1.
2.3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [16].
- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu
thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã
xây dựng. Giới hạn định lƣợng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong
mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã xây dựng với độ chính xác và
độ đúng thích hợp.
- Cách xác định: Sử dụng phƣơng pháp dựa trên độ lệch chuẩn, làm trên mẫu
thử. Làm 10 lần song song.
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x
tb