BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
PHẠM KIM ANH

NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH

NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thuận MỤC LỤC
CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ Trang
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu. 2
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B
6
, B
12
2
1.1.1.1. Vitamin B
1
(Thiamin) 2
1.1.1.2. Vitamin B
6
(Pyridoxin) 2
1.1.1.3. Vitamin B
12
(Cobalamin) 3
1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B
1
, B

2.2.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu 17
2.2.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính 17
2.2.2.3. Độ lặp lại 18
2.2.2.4. Độ đúng 18
2.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp trên một số chế phẩm thuốc lƣu hành trên thị
trƣờng 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 21
3.1. Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn và thử. 21
3.1.1. Pha mẫu trắng và dung dịch chuẩn gốc 21
3.1.2. Pha dung dịch chuẩn 21
3.1.3. Pha dung dịch thử 22
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 22
3.2.1. Khảo sát thành phần pha động 22
3.2.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 24
3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên bản mỏng và các điều kiện
sắc ký khác. 24 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 26
3.3.1. Bán định lƣợng B
1
và B
6
26
3.3.1.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 26
3.3.1.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính. 27
3.3.1.3. Độ lặp lại và độ đúng. 29
3.3.2. Bán định lƣợng B
12

f

: Hệ số lƣu giữ
RSD
: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation).
Thiamin .HCl
: Thiamin hydroclorid
TLC
: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography).
USP
: Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoea).
UV
: Tử ngoại (Ultra Violet).
VIS
: Khả kiến (Visible). DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B thƣờng
dùng và ƣu nhƣợc điểm

5
Bảng 1.2: So sánh một số tham số của TLC và HPTLC

36
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng – B
12

37
Bảng 3.7: Phần trăm hàm lƣợng các vitamin trong các chế phẩm so với
nhãn

38 DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Trang
Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC
11
Hình 3.1: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 1
23
Hình 3.2: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 2
23
Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu trên bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254
kích thƣớc 20 x 10 cm

ở bƣớc
sóng 366 nm

30
Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B
12
khi quan sát dƣới ánh sáng
khả kiến

32
Hình 3.10: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B
12
thu đƣợc với phần
mềm VideoScan

33
Hình 3.11: Đƣờng chuẩn vitamin B
12

34
Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B
12
ở ánh sáng
khả kiến

35
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trên thị trƣờng có rất nhiều loại thuốc chứa hỗn hợp các

6
, B
12
trong
hỗn hợp bằng HPTLC.
2. Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng.
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu.
Mặc dù trên thị trƣờng có rất nhiều các chế phẩm multivitamin mà thành
phần là hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí có chế phẩm chứa tới 9 – 10 loại
vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi
chỉ nghiên cứu bán định lƣợng các vitamin B
1
, B
6
, B
12
trong các chế phẩm
thuốc chứa 3 loại vitamin này.
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B
6
, B
12
[6], [13].
1.1.1.1. Vitamin B
1

- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri – beri, phối hợp với B
6
, B
12
điều
trị các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh lƣng, hông, dây thần kinh sinh ba,
dùng trong trƣờng hợp mệt mỏi, kém ăn, suy dinh dƣỡng.
1.1.1.2. Vitamin B
6
(Pyridoxin)
- Vitamin B
6
là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở vị trí
nhóm chức số 4 là: pyridoxol, piridoxal, pyridoxamin (1). Chế phẩm dƣợc
3

dụng là dạng muối pyridoxol hydroclorid, thƣờng gọi là pyridoxin
hydroclorid (2).
N CH
3
OH
R
HOH
2
C
R= CH
2
OH: Pyridoxol
R=CH
2

B
12
là cyanocobalamin, công thức:

- Tính chất: Cyanocobalamin là những tinh thể màu đỏ tối hoặc bột vô
định hình, tan đƣợc trong nƣớc (1g/1,3ml), EtOH (1g/1,3ml), không tan trong
chloroform và ether. Cyanocobalamin hấp thụ mạnh cả bức xạ vùng tử ngoại
4

và khả kiến, dễ bị phân hủy bởi các tác nhân nhƣ oxi, ánh sáng mặt trời, độ
ẩm, các ion kim loại, khi ở trong dung dịch nƣớc có mặt các chất khác nhƣ
vitamin B
1
, C, PP
- Tác dụng: Điều trị các bệnh thiếu máu ƣu sắc hồng cầu to do thiếu
vitamin B
12
, phòng thiếu máu khi phẫu thuật cắt dạ dày hoặc hồi tràng, viêm
đau dây thần kinh
1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B
1
, B
6
, B
12
trên thị trƣờng [2].
Trên thị trƣờng hiện nay có rất nhiều loại chế phẩm chứa B
1
, B
6

6
, B
12
ở liều nhỏ hơn dạng thuốc 3B nói trên hàng
chục lần với các loại vitamin và acid amin khác: viên nang (Moriamin Forte –
CT Roussel Việt Nam, Vitacap – CT TNHH Mega Lifesciences Thái Lan ),
viên sủi (Sunlife Multivitamin của Đức, Haas Multivitamin của Hungari ),
dạng siro uống (Pediakids – Pháp, TGB Kidbaomin Plus – Việt Nam )
5

1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử
dụng hiện nay (bảng 1.1). Phƣơng pháp định
lƣợng
Ƣu điểm chính
Nhƣợc điểm chính
Quang phổ UV-VIS
[3].
- Tiến hành nhanh.
- Cho kết quả có độ
chính xác cao.

- Chỉ định lƣợng đƣợc hỗn hợp
chứa 2-3 thành phần, không
định lƣợng đƣợc đồng thời
nhiều hoạt chất.
- Không đặc hiệu.


Bảng 1.1: Các phương pháp định lượng hỗn hợp vitamin 3B thường
dùng và ưu nhược điểm.

6

Ngoài ra, hiện nay phƣơng pháp điện di mao quản cũng đã đƣợc nghiên
cứu để định lƣợng hỗn hợp các vitamin tan trong nƣớc [5].
Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của các phƣơng
pháp định lƣợng trên, đó là thao tác phức tạp, thời gian tiến hành lâu (HPLC,
phƣơng pháp định lƣợng riêng từng thành phần) hoặc không định lƣợng đƣợc
mẫu có thành phần phức tạp (UV – VIS). Lý do là HPTLC có thao tác đơn
giản, cho phép phân tích đƣợc đồng thời một số lƣợng lớn mẫu thử chứa
nhiều hoạt chất nên tiết kiệm thời gian. Ngoài ra nó còn một số ƣu điểm khác
nhƣ có độ chọn lọc cao, sử dụng lƣợng nhỏ dung môi cho pha động nên tiết
kiệm chi phí, tránh ô nhiễm môi trƣờng [14], [15].
1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [1],
[14], [19].
1.2.1. Nguyên lý chung của TLC
- Sắc ký lớp mỏng là một trong các kỹ thuật tách sắc ký, trong đó dung
dịch chất phân tích đƣợc di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn.
Trong quá trình di chuyển, các thành phần trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc
chuyển dịch trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác
nhau tùy vào bản chất của chúng. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp
mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất
của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
- Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
lƣu giữ R
f
đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và

cellulose trao đổi ion, cát biển, gel sephadex… Nhiều khi ngƣời ta còn đƣa
thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
cần phân tích.
- Khi phân tích vitamin thƣờng dùng pha tĩnh silica, khi đó quá trình sắc
ký sẽ dựa trên cơ chế hấp phụ.
1.2.3. Pha động trong TLC
- Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với
nhau theo tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Tiêu chuẩn quan trọng
nhất để chọn hệ dung môi pha động là độ phân cực và pH của nó. Cách tốt
nhất là lựa chọn pha động bằng thực nghiệm dựa trên cơ sở:
- Về độ phân cực: nếu chất phân tích có độ phân cực kém, chọn chất hấp
phụ phân cực mạnh (silica gel, Al
2
O
3
), hệ dung môi khai triển có độ phân cực
8

kém (hexan, toluen, benzen ). Ngƣợc lại chất phân tích dạng ion hay phân
cực sẽ đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân cực (methanol, nƣớc ).
- Về độ pH của pha động: Nếu thêm một lƣợng nhỏ acid acetic hoặc
amoniac vào dung môi chứa nƣớc sẽ làm tăng đáng kể độ tan của base hoặc
acid tƣơng ứng, chất phân tích sẽ di chuyển nhanh hơn và vết gọn hơn.
1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC
1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng
Đối với bản mỏng silica gel, khi bảo quản trong điều kiện thƣờng, các đơn
vị silanol chứa nhóm hydroxyl của silica gel dễ dàng hấp phụ nƣớc trong
không khí, làm giảm khả năng hấp phụ chất phân tích của nó. Do vậy, bản
mỏng silicagel thƣờng đƣợc sấy ở 100 – 120
o

phát hiện thích hợp. Một số kỹ thuật thƣờng gặp:
- Phun thuốc thử hiện màu. Thuốc thử chung để nhận biết nhiều chất hữu
cơ là acid phosphomolypdic, acid sulfuric đặc, hơi iod. Ngoài ra còn các
thuốc thử đặc hiệu với từng chất nhƣ ninhydrin để nhận biết acid amin và các
nhóm chức amin, rhodamin B để nhận biết các chất lipid
- Soi dƣới đèn UV: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ sẽ tối đi hoặc
phát quang khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 hoặc 366 nm.
- Dùng densitometer: Thiết bị này sẽ đo cƣờng độ tia phản xạ từ bề mặt
bản mỏng khi soi dƣới đèn UV – VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ đƣợc ghi
lại thành pic sắc ký.
1.2.4.5. Định lƣợng các chất trong vết sắc ký
Có hai phƣơng pháp định lƣợng các chất trong vết sắc ký:
- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm
sạch dịch chiết rồi định lƣợng chất phân tích bằng phƣơng pháp thích hợp.
- Định lƣợng trực tiếp trên bản mỏng bằng cách đo diện tích hay cƣờng độ
màu của vết sắc ký, sử dụng 2 kỹ thuật:
10

Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cƣờng độ hấp thụ
hoặc huỳnh quang.
Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: quét bản mỏng với hệ thống phân
tích hình ảnh, ví dụ camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình
ảnh của vết sắc ký, sau đó xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính.
1.2.5. Ứng dụng của TLC
TLC đƣợc ứng dụng trong định tính, thử tinh khiết, định lƣợng, bán định
lƣợng các chất trong hỗn hợp nhiều thành phần.
1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng
thông thƣờng. Điểm khác là kỹ thuật này sử dụng bản mỏng hiệu năng cao có
lớp pha tĩnh mỏng hơn, với bột mịn có kích thƣớc hạt nhỏ hơn, độ đồng đều

Cao
Thấp hơn.
Giới hạn phát hiện (sử dụng máy đo
độ hấp thụ UV – VIS).
100 – 500 pg
1 – 5 ng
Giới hạn phát hiện (sử dụng máy
quét huỳnh quang).
5 – 10 pg
50 – 100 ng

Máy tính có
phần mềm
VideoScan
Máy chấm
mẫu tự động
Bình triển
khai sắc ký
Buồng
chụp
Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC.

12

So với TLC, HPTLC đã kế thừa đƣợc những lợi thế vốn có và mang một
số ƣu điểm trội hơn: cho vết sắc ký gọn hơn, khả năng tách tốt hơn. Đồng
thời, các bƣớc của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển sắc ký,
nhận diện vết đƣợc tiến hành bán tự động, các thông số đƣợc kiểm soát một
cách chặt chẽ giúp giảm thiểu tối đa các sai số ngẫu nhiên gặp phải, nhất là ở
khâu đƣa mẫu lên bản mỏng, cho kết quả có độ lặp lại và độ đúng cao hơn

1
, B
6
, B
12
trên thị trƣờng và một
chế phẩm không chứa các vitamin này đƣợc dùng làm mẫu trắng (bảng 2.1):

Tên
biệt
dƣợc
Dạng
bào chế
Thành phần, hàm lƣợng
hoạt chất
Nhà sản xuất
Số lô, ngày sản
xuất, hạn dùng
Betex
Viên
nén bao
phim
Thiamin .HCl: 100 mg
Pyridoxin .HCl: 200 mg
Cyanocobalamin: 200 µg

Công ty
TNHH The
United Drug
(1996), Thái

(bảng 2.2):
Bảng 2.1: Các chế phẩm được nghiên cứu trong khóa luận.

15

Bảng 2.2. Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích
Tên biệt
dƣợc
Dạng
bào chế
Thành phần, hàm lƣợng
hoạt chất
Nhà sản xuất
Số lô, ngày
sản xuất, hạn
dùng
Nebamin
Viên
nén bao
đƣờng
Thiamin .HCl: 50 mg
Pyridoxin .HCl: 250 mg
Cyanocobalamin: 250
µg
Công Ty
CPDP Trung
Ƣơng 25
(UPHACE),
Việt Nam.
Số lô: 312561

Indonesia

Số lô:
T 1177904
HSD:
10/09/2015
2.1.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử.
- Nƣớc cất, ethanol, chloroform, acid acetic, amoniac đạt tinh khiết phân
tích.
- Chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, đạt tiêu chuẩn
Dƣợc Điển Việt Nam IV: thiamin hydroclorid hàm lƣợng 99,87%, pyridoxin
hydroclorid hàm lƣợng 99,97%, cyanocobalamin 99,67%.
16

2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị.
- Máy siêu âm Bandelin Sonorex Super RK 106
- Máy ly tâm KUBOTA 6500
- Máy quang phổ UV-VIS Cary 60
- Hệ thống máy HPTLC CAMAG gồm:
Máy sấy bản mỏng
Máy chấm sắc ký LINOMAT 5
Máy khai triển sắc ký ADC2
Buồng chụp ảnh sắc ký TLC VISUALIZED
Phần mềm xử lý kết quả: VideoScan
- Cân phân tích AUW 220
- Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (MERCK, Đức)
- Các dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, cốc có mỏ, đũa thủy tinh,
bình chiết, bình nón, ống nghiệm, phễu lọc, giấy lọc.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện phát hiện