p m
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN HỮU VÃN
ĐỊNH LƯỢNG SABUTAMOL, GUAIFENESIN,
BROMHEXIN HYDROCLORID TRONG VIÊN NÉN
ASCORIN (ẤN Độ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001- 2006)
Người hướng dẫn: Th.s Đặng Trần Phương Hồng
PGS.TS Trần Tử An
Nơi thực hiện: Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm
Trường Đại học Dược Hà Nội
íầ
Hà nội, 5-2006
m
%
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Vật lý- Viện kiểm
nghiệm. Trong quá trình thực hiện khoá luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn
tận tình của các thầy, cô hướng dãn, các giảng viên của bộ môn Hoá phân tích và
độc chất, và các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS-TS Trần Tử An - Chủ nhiệm bộ môn Hoá phân tích và độc chất -
Trường đại học Dược Hà Nội.
- Th.s Đặng Trần Phương Hồng - Trưởng phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm-
Bộ Y tế.
Đã trực tiếp giúp đỡ tôi những tài liệu và hướng dẫn những kỹ năng cần thiết
để tôi thực hiện khoá luận này.
Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá phân tích
và độc chất- Trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ của phòng Vật lý- Viện


15
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét

18
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18
2.2.2. Thẩm định chương trình sắc ký 24
2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

24
2 2 2 2 . Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp

25
2.2.2.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
28
2.2.2.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp

31
2.3. So sánh hiệu quả của phưcỉng pháp tìm được với một số phương
pháp định lượng đã được chấp nhận 37
2.4. Bàn luận về kết quả 42
Phần 3: Kết luân 43
CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
BH
: Bromhexin hydroclorid
GU :
Guaifenesin
HPLC :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
SA

HPLC.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. SALBUTAMOL.
1.1.1. Công thức cấu tạo : [ 1]
- Tên khác : Albuterol, Ventolin, Sultamol, Proventil.
- Tên khoa học ; 1- (4’ - hydroxyl- 3’ - hydroxyl methyl- phenyl) - 2-
tertbuthyl amino ethanol.
Hoạt chất được sử dụng trong phương pháp định lượng là
salbutamol sulfat.
1.1.2. Tính chất ( dạng muôi sulfat) [15]:
- Bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng.
- Tan trong nước, ít tan hơn trong cồn, cloroform, ether.
- Hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ ở 276 nm.
1.1.3. Một sô phương pháp định lượng:
- Phương pháp HPLC.
Bảng 1: Điều kiện định lượng SA bằng HPLC
Cột Pha động (tỷ lệ)
Detector
ƯV(nm)
Tốc độ dòng
(ml/phút)
Tài liệu
CN
(200 X 5 mm,
5 ụm)
Nước- amoni acetat-
isopropanol,
(65 : 30 : 5)
276
1,0

1.2. BROMHEXIN HYDROCLORID.
1.2.1. Công thức cấu tạo [17]:
C1
Tên khoa học : 2- amino- 3,5 - dibromo benzyl methyl cyclohexyl amin
hydroclorid.
1.2.2. Tính chất [17]:
- Trắng hay hầu như trắng.
- Tan trong ethanol 95% và trong methanol, tan nhẹ trong cloroíorm, rất ít
tan trong nước.
1.2.3. Một sô phương pháp định lượng :
Bảng 3: Điều kiện định lượng BH bằng phương pháp đo quang
Mẫu trắng
Bước sóng
(nm)
Al%
^ I cm
Tài liệu
acid acetic
317
87
[17]
ethanol 249
270
[18]
1.3. GUAIFENESIN.
1.3.1. Công thức hoá học [19]:
0
- Tên khoa học: 3- ( 2 -methoxy phenoxyl) - 1,2 propadiol.
1.3.2. Tính chất [19]:
- Bột trắng hoặc gần như trắng, không mùi.

- Van bơm mẫu : Van này để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những
lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Các van này có thể
tích thay đổi, thường là 20, 50, 100 pl.
1
Hình 1: Sơ đồ nguyên tắc chung cho các máy sắc HPLC
(ỉ - Bình chứa pha động; 2- Bơm; 3- Tiêm mẫu; 4- Cột;
5- Detector; 6- Ghi tín hiệu.)
- Cột tách : Là cột chứa pha tĩnh quyết định hiệu quả của sự tách một hỗn
hợp mẫu. Cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau, và thường có chiều dài từ 10- 25
cm, đường kính trong từ 2- 5 mm.
- Hệ thống phát hiện chất phân tích (detector): Dựa theo tính chất của các
chất cần phân tích mà người ta sử dụng các detetor khác nhau, ví dụ như :
^ Detector hấp thụ UV- VIS.
Detetor huỳnh quang.
Detector điện hoá (đo dòng, độ dẫn, điện lượng).
^ Detetor chiết xuất.
^ Detetor độ dẫn nhiệt.
Trong các loại trên thì detector hấp thụ UV- VIS được dùng phổ biến hcfn
cả.
- Hệ thống thu nhận và xử lý kết quả : ở đây có nhiều loại, nhưng phổ biến
hơn cả là máy tự ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
1.4.3. Các đại lượng đặc trưng [3]:
Các chất khi qua, muốn tách được hoàn toàn khỏi nhau cần phải dám bảo
được hai yếu tố:
- Các pic phải cách xa nhau, tức là có tốc độ di chuyển khác nhau rõ rệt.
- Pic sắc ký phải gọn (hẹp và cân đối), tức là không có sự doãng pic.
* Một sô đại lượng đặc trưng:
a. Thời gian lưu (t¡ị):
Thời gian lull là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào cột
sắc ký, tới detetor và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh

0,75 : Hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
1,0 : Hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
1,5 : Hai pic tách nhau gần hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%-
d. Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H):
Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lớp sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là
đĩa lý thuyết. H là chiều cao đĩa lý thuyết nên:
H = — (L: chiều dài cột).
N
Công thức tính N:
N = \6x
= 5,54x
w là chiều rộng đo ở đáy pic.
w 1 / 2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao của pic.
Cột có N lớn hay H nhỏ là cột có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ.
e. Hệ số bất đối xứng T :
Hệ số bất đối cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công
thức :
T =
2a
Trong đó : Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến
mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC.
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân
tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, hạt thường là hình cầu và kích thước
rất nhỏ, đường kính hạt từ 3- 10 |Jm, diện tích bề mặt riêng từ 50- SOOmVg-
• Phân loại pha tĩnh .
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử. Tương

• Một sô điểm cần được xem xét đê chọn pha động cho phù hợp :
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ dòng pha động.
- pH của pha động.
1.4.6. Nguyên tác lựa chọn pha động và pha tĩnh.
Nguyên tắc lựa chọn: Pha tĩnh thường được chọn có tính phân cực giống các
chất cần tách, và khác với pha động.
Trong HPLC, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt
silicagel) tạo nên hợp chất cơ- siloxan
CH,
/
CH,
tí
CH,
CH,
a-OH +
a - s i~
~.E -Si —
\
1 /
Oỉ,
éih
CWị
CH,
nhóm silanol Dẫn chất Dẫn chất
của silicagel clorosilan siloxan
Nếu gốc R- trong dẫn chất siloxan tạo thành là một nhóm ít phân cực như
octyl (Cg), octadecyl (Cịg) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol.
11

thuốc thử và các chất dưới giới hạn phát hiện).
Đáp ứng của detetor như nhau đối với các chất.
1.5. MỘT SỐ QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BA Dược CHẤT
TRÊN TRONG CÁC CHÊ PHẨM đ a t h à n h PHẦN:
1.5.1. Định lượng BH:
Bảng 5: Điều kiện định lượng BH bằng HPLC
Cột Pha động (tỷ lệ)
Detector
UV(nm)
Tốc độ dỏng
(ml/phút)
Tài liệu
RP18
(250 X 4,6 mm,
10 ụm)
Methanol- Natri
dihydrophosphat 10%,
pH=3,0 (điều chỉnh pH
bằng acid sulfuric đậm
đặc), (55 : 45)
214
1,5
[8]
Lichrosorb Si 60
(250 x4mm; 5
ụm)
Methanol- Đệm amoni
nitrat pH 9,5; (45 : 6)
298
1,0 [14]

Nước cất - Dung dịch
amonipeclorat 0,00 IM
trong methanol,
pH=6,7 (Điều chỉnh pH
bằng NaOH 0,1 N
trong methanol), (2:8)
254
0,8
[7]
* Kết luận:
Theo các nghiên cứu trước đây, các tác giả sử dụng cả hai loại sắc ký là pha
thuận (cột Si 60) và sắc ký pha đảo (cột RP 18). Như vậy, BH và GU có khả năng
thích hợp với cả hai loại sắc ký này.
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành trên cả sắc ký pha thuận
và sắc ký pha đảo, dựa vào kết quả thu được chúng tôi chọn sắc ký pha đảo vì:
- Đáp ứng của hệ đối với sắc ký pha đảo tốt hơn sắc ký pha thuận.
- Loại cột c 18 thông dụng hơn cột Si và sẵn có ở phòng thí nghiệm.
14
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.1.1. Hoá chất và dụng cụ.
2.1.1.1. Hoáchất.
- Chất chuẩn của viện kiểm nghiệm : salbutamol sulphat (hàm lượng 100%),
guaifenesin, bromhexin hydroclorid 99,9%.
- Methanol loại dùng cho HPLC.
- Triethylamin.
- Acid sulfuric đặc.
- Natri dihydrophosphat loại tinh khiết.
2.1.12. Dụng cụ :
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100 với detector u v , cột Lichrosorb

Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê để đánh giá.
2.12.3. Một số công thức tính thống kê xử lý kết quả [2], [9], [13];
- Loại bỏ những dữ liệu ngoại lai {Chuẩn Q):
Chuẩn này áp dụng cho N< 10.
Các dữ liệu thống kê được sắp xếp tăng dần: X), Xj, X3, , x„
16
Tính chuẩn Qtn để loại bỏ giá trị nghi ngờ hoặc
- X.,
Đánh giá ô,„= —
Đánh giá x^i,: Q,„ =
X — X
max •^min
Xọ Xị
X — X
max min
So sánh giá trị Q(n với Q tới hạn (Q“');
Qtn < Q* thì không loại giá trị nghi ngờ.
- Giá trị trung bình:
- Độ lệch chuẩn:
- Phương sai s^:
= - . Z ^ ,
n /=1
¿(x ,-x )^
j=Ị
___________
n - \
ì n -
Ẻ (^ ,-ĩF
A^-1
- Sai số chuẩn:

sang những hệ ưu tiên pha động BH. Sau một số khảo sát, chúng tôi chọn được hệ
pha động Methanol - Natri dihydrophosphat 10%, pH=3, tỷ lệ 60: 40. Hệ này cho
pic của cả ba chất cần khảo sát, và các pic có độ phân giải khá tốt. Tuy nhiên, pic
18
của BH có hệ số bất đối lớn, pic bị kéo đuôi. Do vậy chúng tôi thêm triethylamin
(TEA), một chất có khả năng làm giảm bất đối xứng của pic. Hoà tan TEA trong
methanol với tỷ lệ tăng dần và ở tỷ lệ 1/300 cho pic của BH đạt độ cân xứng tốt,
T= 1,52.
Vậy, hệ pha động chọn được:
(Methanol- Triethylamin tỷ lệ 300:1)- Natri dihydrophosphat 10%, pH3,0;
tỷ lệ (60: 40).
- Lựa chọn loại cột: Theo tài liệu nghiên cứu tìm hệ dung môi pha động, tác
giả sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (250x4 mm, 10|Jm). Cột này có khả năng tách
tốt hệ ba chất cần khảo sát, cột có hiệu lực cao với số đĩa lý thuyết trung bình
4023 và là loại cột thông dụng trong công tác kiểm nghiệm.
- Lựa chọn tốc độ dòng : Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký của dung dịch mẫu
chuẩn ở các tốc độ khác nhau là 1,0; 1,5; 2,0 ml/ phút thì thấy rằng tốc độ dòng ở
1,5 ml/ phút các pic được tách tốt, áp suất (231 bar) vừa phải và thời gian lưu
không quá dài (của SA là 1,47 phút, GU là 2,16 phút và của BH là 12,23 phút), ở
đây, nếu chỉ nhìn trên sắc đồ chuẩn thì ta sẽ thấy độ phân giải giữa BH và GU là
rất lớn. Tuy nhiên, trên sắc đồ chất thử xuất hiện một pic của tá dược gần sát phía
sau GU. Để pic này tách hoàn toàn khỏi GU thì độ phân giải giữa BH và GU phải
lớn, và tốc độ dòng 1,5 ml/ phút là hợp lý.
- Lựa chọn bước sóng thích hợp để phát hiện ba ch ấ t: Để xác định bước sóng
thích hợp để phát hiện ba chất, chúng tôi tiến hành quét phổ UV-VIS của các
dung dịch chuẩn riêng rẽ của ba chất trên dải sóng 200- 400 nm (hình 3, 4 và 5).
SA là chất có nồng độ định lượng thấp nhất trong cả ba chất nên lựa chọn ưu
tiên cho SA. Nhận thấy ở bước sóng 225 và 276 nm, độ hấp thụ của SA đạt cực
đại. Độ hấp thụ của SA ở 225 nm lớn hơn ở 276 nên chúng tôi chọn bước sóng
225 nm là bước sóng định lượng SA.