BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
/ o % 40i ^ f
iar/f~Y7G^'
\\VỈ:
TRẦN THỊ KIM OANH
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
TRIFLUORO METHYL DIHYDRO ARTEMISININ
LÊN QUÁ TRÌNH SINH SẢN VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI THAI
ở CHUỘT NHẮT TRẮNG
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001 - 2005)
Người hướng dân
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
: TS. Nguyễn Xuân Trường
TS. Trương Văn Như
: Bộ môn Dược lực - Trường
ĐH Dược Hà Nội
Viện SR - KST - CT TW
: 04/2005 - 05/2005
HÀ NỘI, THÁNG 5/2
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn:
TS. NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG.
TS.TRƯƠNG VÃN NHƯ.
Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều công sức và
thời gian truyền thụ những kiến thức quí báu, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này.
Em xin tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Dược lực
đã chỉ bảo dạy dỗ em trong suốt quá trình làm khoá luận, cũng như trong thcyị
gian học tập tại trường.

10
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
13
2.1. Nguyên liệu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu
13
2.1.1. Nguyên liệu 13
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 13
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh
sản (đột biến gen) và lên sự phát triển phôi thai của chuột chửa

2.1.4. Các chỉ số nghiên cứu 16
2.2. Kết quả nghiên cứu 18
2.2.1. Ảnh hưcmg của BB 101 lên quá trình thụ thai và phát triển phôi thai 18
2.2.2. Ảnh hưởng lên sự phát triển phôi thai ở chuột đã chửa

28
2.3. Bàn luận

.

.
30
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 33
3.1. Kết luận 33
3.2. Đề xuất: 33
TÀI LIÊU THAM KHẢO 34
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ART và dx
ART-F
BBIOI

sàng lọc ra các thuốc sốt rét mới, đặc biệt là các hợp chất có tác dụng với các
chủng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc.
lOa - Trifluoro methyl dihydro artemisinin (kí hiệu là BBIOI) là một
dẫn xuất gắn flúor của ART được các nhà khoa học Pháp tổng hợp, thử
nghiệm ban đầu cho thấy tác dụng tốt trên ký sinh trùng sốt rét ở chuột nhắt
trắng. Để góp phần tìm hiểu độc tính và tiếp tục có những cơ sở đánh giá tiền
lâm sàng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ’’Nghiên cứu ảnh hưởng của
Trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát trỉển
phôi thai ở chuột nhắt trắng”.
Đề tài có hai mục tiêu:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh sản của
chuột ở thế hệ bố mẹ (P), thê hệ con F1 và thế hệ con F2.
2. Nghiên cứu ảnh hưỏtig của BBIOI lên sự phát triển phôi thai của
chuột chửa.
PHẦNl
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Lịch sử phát triển của các thuốc chống sốt rét.
Hai ngàn năm trước đây, sách cổ Trung Quốc đã nói đến cây Thường
sơn (Dicho febrífuga Lour. Saxifragaceae) và cây Qinghao (Artemisia annua
L). Nhưng mãi tói thế kỷ 17, khi người Châu âu khai thác và sử dụng cây
Cinchona (cây sốt, fever trees, mọc ở sườn núi Pêru) thì việc nghiên cứu về
mặt hoá học mới thực sự bắt đầu. Năm 1810, A.Gomez (Bồ Đào Nha) và
I.Gize (Nga) thu được tinh thể quinin. Bốn năm sau, P.Pelletier và J. Caventou
phân lập được alcaloid của vỏ cây Cinchona tạo thuận lợi cho việc chiết xuất
quinin ở nhiều nước trên thế giới [6]. Mặc dù vậy, quinin không đủ đáp ứng
nhu cầu cho việc điều trị sốt rét, nhất là trong chiến tranh thế giới. Điều đó đã
thúc đẩy việc nghiên cứu tổng hợp ra các thuốc sốt rét mới. Kết quả là hàng
nghìn hợp chất mới đã được điều chế. Qua sàng lọc nhiều thuốc thuốc sốt rét
mới được đưa vào sử dụng.
Năm 1926, Schuleman, Shoenhofer và Wingler(Đức) đã tổng hợp được

Từ năm 1967 các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra một loại cây thảo
đã được sử dụng từ lâu đời có tên là Qinghao (Artemisia annua L.) Năm 1972
đã tách chiết được artemisinin (Qinghaosu) từ cây Qinghao (Thanh hao).
Artemisinin là một Secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân tử, khác
hẳn với cấu trúc của các thuốc chống sốt rét khác, trong hệ thống dị vòng
không có nitơ.
1.2. Vài nét vê cây Thanh hoa hoa vàng.
1.2.1. Đặc điểm thực vật.
Tên khoa học : Artemisia annua L. Arteraceae.
Tên thường gọi: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng
Cây thảo mọc hàng năm, thân cao tới Im, có rãnh, gần như không lông.
Lá xẻ lông chim 2 lần thành dải hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm. Chuỳ cao ở
ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8- 2,0 mm, lá bắc ngoài hẹp có lông
xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng. Hoa hoàn toàn hình ống, khoảng
15 cái, hoa trong lưỡng tính. Quả bế nhẵn, cao 0,5 mm không có mào lông, ra
hoa vào tháng 6-11, có quả tháng 10-3 và thường lụi vào tháng 5[3].
Theo thông báo của WHO, của Trung Quốc, của Mỹ, trong khoảng 40
loài thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc chỉ có loài Artemisia annua L.
là có chứa hoạt chất chữa sốt rét.
1.2.2. Thành phần hoá học.
Tất cả các bộ phận của cây Thanh hao hoa vàng đều chứa tinh dầu và
hàm lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi
trồng, dao động từ 0,5- 0,6%. Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi thơm long
não với thành phần chủ yếu là camphor, artemisinin ceton, ß-myrcen
[3,10,13].
1.3. Tình hình nghiên cứu ART và dẫn xuất.
1.3.1. Tách chiết.
ART được các tác giả Trung quốc tách chiết lần đầu vào năm 1972
bằng ethyl ether, nhưng mãi đến năm 1977 mới được công bố với tên
Qinghaosu.

* Tính chất lý học .
Artemisinin có dạng tinh thể hình kim, không màu, không mùi, vị hơi
đắng, có điểm nóng chảy 151- 153°c, chịu được nhiệt độ 150°C- 200°c trong
2- 5 phút, nó chỉ bị phân huỷ do chặt đứt cầu peroxid khi nung nóng ở 190"C
sau 10 phút, artemisinin tan rất ít trong nước và trong dầu, có thể bị phân huỷ
trong dung môi phân cực và bị mở vòng lacton, có khả năng hoà tan và khá
bền trong các dung môi không phân cực. Artemisinin không bền trong môi
trường acid hoặc base nhưng rất ổn định trong môi trường trung tính.
* Tính chất hoá học .
Trong phân tử artemisinin có cầu nối peroxid (- 0- 0 ) là mối liên kết
nhạy cảm nhất, có vai trò quan trọng trong hoạt tính chống ký sinh trùng sốt
rét. Với các điều kiện khử hoá thay đổi, phân tử ART bị khử hoá ở các nhóm
khác nhau. Khử hydro hoá ART với tác nhân hydrogen có xúc tác Pd/ CaCOj
khi cầu peroxyd bị mất thì ART không còn có hoạt tính chống sốt rét. Khi khử
ART với borohydid trong methanol nhóm lacton chuyển thành nhóm lactol
cho dihydroartemisinin (không mất cầu peroxid) có hoạt tính chống KSTSR
mạnh hơn cả ART.
1.3.4. Cơ chế tác dụng của ART và dẫn xuất.
Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của ART
và dx của nó, nhưng cho đến nay cơ chế tác dụng của nó vẫn là vấn đề còn
tranh luận. Tuy nhiên, tác dụng của nó không đối kháng với acid para
aminobenzoic, chứng tỏ cơ chế tác dụng của nó khác với chloroquin và các
thuốc kháng folic khác. Cơ chế tác dụng của ART và dx có thể là sự phối hợp
của các cơ chế khác nhau như tác động lên màng tế bào, tạo ra các gốc tự do
hay oxy hoạt động
Nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng hệ thống màng
của KST là nơi tác dụng chính của ART. Trước hết là những biến đổi về cấu
trúc màng, sau đó là sự phồng lên của các ty thể, màng nhân và cuối cùng làm
tan rã cấu trúc bên trong của KST. Trong giai đoạn hồng cầu invitro những
biến đổi đó xuất hiện trong vòng 1- 4h sau khi tiếp xúc với thuốc. Ellis và

sự sinh trưởng và phát triển của chuột thử nghiệm và không làm xuất hiện các
dị tật bẩm sinh [4].
Thực nghiệm trên chuột nhắt trắng được uống dihydroartemisinin liều
100 mg/ kg thể trọng, không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và
tế bào tinh hoàn ở chuột nhắt trắng, không ảnh hưcmg đến quá trình sinh sản,
phát triển phôi thai, phát triển của chuột con ở thế hệ Fl, F2 và không gây các
dị tật bẩm sinh [15].
Trương Văn Như và cộng sự cũng cho thấy: artesunate uống liều 50 mg/
kg ngày đầu , 25 mg/ kg X 4 ngày sau và liều 25 mg/ kg ngày đầu; 12,5 mg/
kg X 4 ngày sau, nhắc lại 2, 3 đợt, không gây ảnh hưởng đến nhiễm sắc thể ở
tế bào tuỷ xưoíng và tế bào tinh hoàn của chuột nhắt trắng [1 r .
Nghiên cứu về đột biến trên động vật của các tác giả nước ngoài đã cho
thấy ART không phải là chất gây đột biến, không gây quái thai ở bào thai
chuột cống [16]. Tuy nhiên một số tác giả Trung Quốc cho rằng ART độc với
bào thai chuột nhắt và chuột cống chủng XVistar, đặc biệt trong thời kỳ giữa và
muộn của bào thai, ở liều 1/400 của LD50 có một nửa các bào thai bị hấp thụ,
uống liều 1/25 của liều LD50 gây ra một số dị hình như thoát vị rốn, 100%
bào thai bị hấp thụ.
*Ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi thai:
ở những chuột nhắt trắng: sau khi thụ thai ngày thứ 6- 15, tiêm
artemether 5,4 mg/ kg, không thấy ảnh hưởng rõ ràng tới trọng lượng, độ dài,
ngoại hình của thai và chuột con đẻ ra. Khi đưa liều 10,7 mg và 21,4 mg/ kg
thì có 30% và 100% bào thai bị teo, nhưng ở liều 21,4 mg/ kg tiêm vào ngày
thứ 12-17 của thời kỳ mang thai thì không ảnh hưởng đến sự phát triển của
thai [18].
Trên chuột cống và thỏ cho thấy: Với liều 5,4 mg/ kg không gây ảnh
hưởng đến sự phát triển của thai. Với liều 21,4 mg/ kg, thì bào thai bị teo.
artemether cho độc tính cao hơn arteether đối với phôi thai của chuột nhắt và
chuột cống [18].
Nghiên cứu tiền lâm sàng của ARTECEF BV, Maarssen, The

các thuốc chống sốt rét kinh điển nhưng việc sử dụng còn nhiều hạn chế do
khả năng hoà tan kém của nó trong nước cũng như dầu, thời gian bán thải
ngắn, điều đó gây tỷ lệ tái phát đáng kể (20- 50%) [1, 5,14]. Để thay đổi dược
động học và thu được dạng thuốc có tác dụng dược lý tốt hơn, các nhà khoa
học trên thế giới đã nghiên cứu bán tổng hợp từ nó ra các dẫn xuất mới bằng
cách gắn fluor vào dẫn xuất dihydroartemisinin dựa trên những đặc tính nội lại
do các nguyên tử flour có trong phân tử đem lại. Khi thay thế các nguyên tử
flour vào những nguyên tử hydro đã làm tăng khả năng hoà tan của phân tử,
đồng thời cũng làm tăng tính ổn định của dẫn xuất trong quá trình chuyển hoá
(do liên kết C- F rất bền vững ), như vậy có thể hy vọng sẽ làm tăng thời gian
bán thải.
Trương Đình Thạc và cộng sự (Viện hoá công nghiệp) và Jean Pierre
Bugue (Pháp) đã tìm cách gắn fluor vào phân tử artemisinin, để ổn định được
dạng hemiacetal của dihydroartemisinin. Các dẫn xuất ether gắn fluor của
dihydroartemisinin sẽ chuyển hoá chậm hơn, làm chậm quá trình oxy hoá bởi
emzym cytocrom ^450-
Các dẫn xuất ether của ART có chứa fluor được điều chế theo 3 phương
pháp sau :
- Cho dihydroartemisinin tác dụng với alcol có chứa fluor, chất xúc tác
đặc hiệu BF3Eí20
- Cho dihydroartemisinin tác dụng với alcol có chứa fluor, chất xúc tác
là CLSÌ(CH3)3
- Áp dụng phản ứng Mitsunobu. ^
Trên nguyên tắc của các phưoỉng pháp trên, nhóm BIOCIS - Chatenay
đã tổng hợp được 2 dẫn xuất gắn fluor của dihydroartemisinin, một trong số
đó là ; lOa - triflouromethyldihydroartemisinin (ký hiệu là BBIOI).
Hình 1.3.10a-trifluoromethydihydroarteiĩiisinin.
BBIOI có tác dụng diệt KST sốt rét nhanh và mạnh hơn ART. Thử
nghiệm với liều 50mg/kg chuột nhắt trắng thấy 100% chuột sạch KST sau 24h
điều trị, tỉ lệ khỏi là 100% không thấy tái phát trong vòng 60 ngày với cả

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu.
* Chuột nhắt trắng ( Mus musculus L) chủng Swiss do viện VSDT cung
cấp, số lượng 160 con cả hai giống đực và cái cùng độ tuổi, trọng lượng trung
bình 25 ± 2g, được nuôi dưỡng trong những điều kiện thích hợp về thức ăn,
nước uống như nhau trong suốt quá trình thực hiện. Số chuột trên được chia
thành các lô:
- Các lô chuột cái :
+ Lô uống BBIOI: 60 con.
+ Lô uống gôm arabic 1%: 30 con.
+ Lô không uống BBIOI: 30 con.
- Các lô chuột đực tương ứng:
+ Lô uống BBIOI: 20 con.
+ Lô uống gôm arabic 1%: 10 con.
+ Lô không uống BBIOI : 10 con.
* Chuột nhắt trắng đã có chửa từ ngày 6 - 10, do viện VSDT cung cấp.
Số lượng 20 con, cũng được chia thành 2 lô;
- Lô chuột chửa uống BBIOI: 12 con.
- Lô chuột chửa uống gôm arabic 1%: 10 con
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh
sản (đột biên gen) yà lên sự phát triển phôi thai của chuột chửa.
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên đột biến gen.
Kỹ thuật phát hiện đột biến gen rất phức tạp. Cho đến nay người ta chỉ
phát hiện đột biến gen bằng phương pháp gián tiếp trên những tình trạng của
thế hệ con, kết quả tổ hợp đực cái. Trong đề tài này, chúng tôi chọn te^
Dominant lethal. Các chuột nghiên cứu được chia ngẫu nhiên thành các lô sau:
- Lô chuột cái uống BBIOI 11611(^ 0 / kg / ngày X 5 ngày liẽ n l^ (30
con) ghép với lô chuột đực uống BBIOI liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên
tục liên tục (10 con ).
- Lô chuột cái không uống BBIOI (30 con) ghép với lô chuột đực uống
BBIOI liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên tục (10 con ).

Sau khi uống thuốc nuôi tiếp đến ngày 13 -14, chia số chuột chửa thành
2 nhóm :
+ 50% số chuột cái có chửa được mổ để quan sát số hoàng thể ở mỗi
bên buồng trứng, số thai chết sớm (dạng cục máu màu xẫm), số thai chết
muộn.
+ 50% số chuột cái có chửa còn lại nuôi cho đến khi đẻ để quan sát số
con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng con trong mỗi lứa, số con bị dị tật bẩm sinh.
Toàn bộ số chuột ở các lô nghiên cứu đột biến gen và nghiên cứu ảnh hưởng
lên sự phát triển phôi thai chuột chửa được uống ( BBIOI và gôm arabic ) qua
kim tiêm đầu tù với liều 50mg/kg/ ngày uống mỗi ngày một lần vào lúc 9h
sáng, uống liên tục 5 ngày. Sau khi kết thúc đợt uống thuốc, tiến hành ghép
các lô chuột như trên.
2.1.4. Các chỉ sô nghiên cứu.
• Các chỉ số đánh giá lên quá trình sinh sản ( đột biến gen ) gồm :
- Tỷ lệ thụ thai.
- Tinh trạng phát triển phôi thai:
+ Số hoàng thể.
+ Số thai sống.
+ Số thai chết sớm.
+ Số thai chết muộn.
- Tình trạng chuột con được sinh ra :
+ Số con mỗi lứa.
+ Trọng lượng trung bình ( gam )/con trong mỗi lứa .
+ Số con bị dị tật bẩm sinh.
• Các chỉ sô đánh giá lên sự phát triển phôi thai chuột chửa uống
thuốc.
- Tinh trạng phát triển phôi thai:
+ Số thai sống.
+ Số thai chết sớm.
+ Số thai chết muộn.

đạt 20g/con.
Sau đó các bước
tiến hành và quan
sát như ở thế hệ p.
Tỷ lệ
Tinh trạng phát
Tinh trạng chuột
thụ thai
triển phôi thai
con được sinh ra
Thê hê p
Thế hê F1
Thế hệ F2
' ' ' ' w
Theo dõi chuột con
mới sinh ra đến khi
đạt 20g/con
Sau đó các bước
tiến hành và quan
sát như ở thế hê F l.
Lô uống BB 101
Lô uống gôm 1%
Tmh trạng phát
triển phôi thai
Tinh trạng chuột
con được sinh ra
Hình 2.1. Mô hình Nghiên cứu ảnh hưởiig của BBIOI lên quá trình sinh sản chuột nhắt trắng
và lên quá trình phát triển phôi thai của chuột chửa
2.2. Kết quả nghiên cứu.
2.2.1 Ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình thụ thai và phát triển phôi thai.

76,7
ElLô uống BB 101
^ Lô chứng
Bảng 2.2. Tỷ lệ thụ thai (%) của lô chuột cái không uống BBIOI ghép với
chuột đực uống BBIOI ở thế hệ p so với lô chứng (X ± SD).
Thế hệ
chuột
Chỉ sô nghiên cứu
Lô nghiên cứu
(n )
Ngày thụ
thai
Số chuôt thu thai
(n )
Tỷ lê thu thai
(%)
p
Uống BB 101(1)
30
(1) (5)
23
76,7
Chứng (2) 30
24 80
p(l-2)
>0,05 >0,05
Ghi chú : (I) (5) là ngày thứ nhất đến ngày thứ năm sau khi ghép l đực + 3 cái.
Nhận xét: Kết quả trên bảng 2. 2 cho thấy các chỉ số ngày thụ thai, tỷ
lệ thụ thai đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê giữa lô chuột cái
không uống BBIOI ghép với lô chuột đực uống BBlOlso với lô chứng

>0,05
Ghi chú : (l) ị5) là ngày thứ nhất đến ngày thứ năm sau khi ghép Iđực + 3 cái.
Nhận xét ; Kết quả trên bảng 2. 3 cho thấy các chỉ số ngày thụ thai, tỷ
lệ thụ thai đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê giữa lô chuột cái
uống BBIOI ghép với lô chuột đực không uống BBIOI so với lô chứng.
80
83
iLôuốngBB 10
0 Lô chứng
* Tình trạng phát triển phôi thai.
Tình trạng phát triển phôi thai của các lô chuột nghiên cứu được Irình
bày ở bảng 2.4 - 2.6 và biểu đồ 2.4 - 2.6.
Bảng 2.4. Tình trạng phát triển phôi thai của lô chuột cái uống BBIOI
ghép với chuột đực uống BB101(X ± SD).
Chỉ sô nghiên cứu
Lô nghiên cứu
Lô uống BBIOI (1)
Lô chứng(2)
p(l-2 )
Số chuột được mổ (n)
13 12
Số trứng làm tổ
9,08 ± 1,22
9,58 ± 1,37
>0,05
Số thai sống
8,76 + 2,21 9,41 ± 2,40
>0,05
Số thai chết sớm
0,16 ±0,28 0,17 ±0,29